Stanovení metadonu
Synonyma
methadon, methadon hydrochlorid, methadonum
4,4-difenyl-6-dimethylaminoheptan-3-on hydrochlorid
Adanon, Adanon hydrochloride, Adolan, Algidon, Algolysin, Algovetin,
Althose hydrochloride, Amidon, Amidone, Biscuits, Butalgin, Depridol, Diaminon,
Diaminon hydrochloride, Dolofin hydrochloride, Dollies, Dolohepton, Dolophin,
Dolophin hydrochloride, Dolophine, Dolly, Eptadone, Fenadon, Fenadone,
Heptadon, Heptadone, Heptanon, Ketalgin, Ketalgin hydrochloride, Mecodin,
Medicine, Mephenon, Metasedin, Meth; Methadone HCL Intensol, Methadone M;
Methadose, Methaquaione, Miadone, Moheptan, Phenadone, Phenadone hydrochloride,
Physeptone, Polamidon, Polamidone, Racemic methadone, Racemic methadone
hydrochloride, Symoron, Tussal, Tussol, Westadone
Preanalytická fáze
Stanovení v moči (případně v krvi,
séru, slinách nebo vlasech). Vzorky je třeba skladovat v lednici při 2 – 8
°C po dobu 24 – 48 h; delší skladování vyžaduje -20 °C. Opakované zamrazování
vzorků se nedoporučuje. Nepřidávat do vzorku moče azid sodný jako stabilizátor.
Doba účinnosti 13 – 47 h. Biologický
poločas 15 – 30 h. Průkaz v moči 2 – 4 dny po aplikaci.
Je vhodné sledovat potenciální pokusy o ovlivnění výsledku (naředění moče,
přídavek oxidujících, redukujících a bělicích látek, či výraznou úpravu pH
moče).
Imunochemické postupy jsou nejběžnější (RIA, EIA, FIA). Zejména
jednoduché kvalitativní testy s jednoúčelovými proužky nebo pro multidrogový
screening. Test prokazuje přítomnost drogy, tj. metadonu v moči. Konjugát
(metadon-protein) imobilizovaný v membráně testovací destičky soutěží
kompetitivně s metadonem přítomným v testované moči o možnost
navázaní se na omezené množství koloidním zlatem značených protilátek
nanesených na začátek testovací membrány. Barevné monoklonální protilátky proti
metadonu jsou spolu s močí posunovány po membráně. Pokud v moči
metadon není, dostanou se nenavázané protilátky až k pásu konjugátů v oblasti označené
písmenem T (Test region) a vytvoří
zde barevný pruh, což znamená negativní výsledek testu. Pokud je v moči
metadon přítomný, navážou se na ně protilátky hned na počátku membrány a
k pásu konjugátů se již jako volné nedostanou. V oblasti označené
písmenem T proto žádný barevný pás nevznikne, což znamená pozitivní výsledek
testu. Podmínkou vydání kvalitativního výsledku testu (pozitivní nebo
negativní) je přítomnost barevného kontrolního pruhu v oblasti membrány
označené písmenem C (Control region).
Ten vytvoří reakce jiného systému antigen/protilátka přidávaného výrobcem do
setu. Kontrolní barevný pruh potvrzuje, že test byl proveden správně a že je
funkční, tj. že bylo na testovací destičku naneseno dostatečné množství moče a
že se moč dobře nasákla do celé plochy testovací membrány. Výhodná je také
možnost poskytovaná některými výrobci a to skenování exponované destičky a
uložení vytvořeného obrázku v elektronické formě, což umožňuje eventuální
pozdější dokladování či jiné využití. Na cut-off
hodnotě 300 µg/l je 96 % shoda výsledků kvalitativního imunochemického testu
s GC-MS.
RIA analýza byla popsána i ve vlasech.
Vychýlení výsledků do 450 µg/l bylo do 6 %. Reprodukovatelnost byla
v sérii CV 3,6 – 6,8 %, mezi sériemi 3,6 – 5,5 %. Detekční limit byl 0,5
µg/l a výtěžnost 80 – 89 %.
Homogenní
imunoanalýza EMIT používá jako značku glukóza-6-fosfát dehydrogenázu,
která pokud není v imunokomplexu oxiduje glukóza-6-fosfát na
glukonolakton-6-fosfát a současně redukuje NAD+ na NADH, což se
sleduje při 340 nm. Metoda má reprodukovatelnost CV 6,3 – 11,8 %.
CEDIA je homogenní
analýza, která využívá kompetice konjugátu metadonu s malým štěpem
β-galaktozidázy a metadonu ze vzorku o volná místa protilátky.
Nespotřebovaný konjugát se opět spojí s komplementárním velkým štěpem
β-galaktozidázy na aktivní enzym, který štěpí
o-nitrofenyl-β-galaktopyranosid a hydrolýza se sleduje při 400 – 420 nm.
Reprodukovatelnost je CV 3,9 – 7,7 %; výtěžnost je 89,0 – 93,1 %.
ELISA je založena na
kompetitivní reakci mezi metadonem ze vzorku a metadonem značeným křenovou
peroxidázou o vazebná místa protilátky, kterou jsou potaženy jamky
mikrotitračních destiček. Po promytí se přidá tetrametylbenzidin a výsledné
zbarvení se po zastavení reakce sleduje při 450 nm vertikální fotometrií. Reprodukovatelnost
v sérii CV 2,36 – 6,6 %.
Homogenní fluorescenční FPIA stanovení lze
provádět v koncentračním rozsahu 50 – 900 µg/l s reprodukovatelností
CV < 7 %.
Chemiluminiscenční multidrogový
biočip umožňuje vyhodnocovat na analyzátoru metadon v krvi s reprodukovatelností
v sérii CV 6,6 – 8,2 % a citlivostí 0,6 µg/l; ve slinách
s reprodukovatelností v sérii CV 7,1 – 8,7 %, mezi sériemi 10,3 –
12,3 %.
Při homogenní metodě KIMS
(kinetická interakce mikročástic v roztoku) je metadon vázán přes
spojovací bílkovinu na karboxylované polystyrénové částice a polyklonální kozí
protilátka volně v roztoku. Po kompetitivní imunoreakci mezi metadonem ze
vzorku a konjugátem metadonu se sleduje zákal imunokomplexu. Cut-off
semikvantitativního testu je 300 µg/l. Reprodukovatelnost pro cut-off
v sérii CV je 1,1 – 2,7 %, mezi dny 3,2 – 4,4 %. Kvantitativní test má
limit detekce 19 µg/l, reprodukovatelnost v sérii CV je 0,8 – 3,2 %, mezi
dny 1,5 – 4,2 %.
Test není vhodný pro soudně lékařské a forenzní potřeby, pro které by
výsledek testu musel být potvrzen vhodnou kvantitativní a specifickou metodou
založenou například na principu GC/MS nebo HPLC.
Kvalitativní TLC začíná adsorpcí metadonu na pryskyřici Amberlite
XAD-2, z které je eluován do směsi etylacetát-izopropylalkohol 85:15.
Eluát je pak rozdělen na silikagelu ve směsi
etylacetát-izopropylalkohol-hydroxid amonný 85:10:5.
GC-MS postup začíná extrakcí
metadonu ze vzorku do vodného metanolu s přídavkem vnitřního standardu (D3-2-etyliden-1,5-dimetyl-3,3-difenylpyrrolidin).
Odparek se rozpustí v etylacetátu a nastříkne na kapilární kolonu. Teplota
stoupá od 70 do 280 °C. Sledují se ionty metadonu 223 a 294. Reprodukovatelnost
v sérii CV je 11 – 14 %, mezi sériemi 11 – 15 %, vychýlení -11 až +9 %.
Na HPLC
koloně je používán jako komplementární ion fluoreskující
9,10-dimetoxyantracen-2-sulfonová kyselina. Rozdělená mobilní fáze je následně
extrahována do chloroformu a analyzována fluorimetrem (excitace 380 nm, emise
445 nm). Detekční limit je 25 µg/l,
vychýlení -5,2 až +6,2 %, reprodukovatelnost má CV 3,9 – 7,7 %.
Interference
Výsledky stanovení
metadonu v moči snižují: tekutá mýdla.
Výsledky stanovení metadonu v moči zvyšují: α-acetylmetadol,
benzodiazepiny (Flunitrazepam, Rohypnol, Valium), clomipramin, cyamemazin,
difenhydramin, doxylamin, etanol, chlorpromazin, kodein, Laam, levomepromazin,
levorfanol, n-metyldietanolamin, Pentazocaine, promethizin, tetrahydrozolin,
thioridazin, verapamil, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-28