Odborné texty›Repetitorium - klinická genetika›Repetitorium - metodické přehledy

Stanovení lipázy

STAEK

Stanovení lipázy (LPS)

 

Synonyma

triacylglycerol acylhydrolasa, EC 3.1.1.3;
triacylglycerollipasa; lipáza; lipasa; jaterní lipasa; triglyceridlipasa; triglyceridasa;
post-heparin plazma protaminrezistentní lipasa; post-heparin lipasa rezistentní vůči soli ; heparinem uvolňovaná jaterní lipasa;
butyrinasa; tributyrasa; tributyrinasa; tributyrinesterasa;
GEH; glycerolesterhydrolasa; triacylglycerolesterhydrolasa;  triglyceridhydrolasa; trioleinhydrolasa;
jaterní monoacylglycerolacyltransferasa;
tweenasa; tweenhydrolasa; tweenesterasa; tween-hydrolyzující esterasa;
PPL; kakordasa; kapalasa L; lipazin; steapsin; triacetinasa;       
amano AP; amano B; amano CE; amano CES; amano P; amno N-AP; GA 56; Meito MY 30; Meito Sangyo OF lipasa; Takedo 1969-4-9;  

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. V češtině se odvozený název EC triacylglycerol lipase vyskytuje zcela ojediněle v jakékoliv variantě (jedno slovo, resp. samostatný kmen; koncovka -áza či -asa), v anglickém názvosloví EC je kmenový základ (např. lipase, hydrolase) vždy samostatně. Mezinárodní zkratka PPL (Google 253 000) je označení pro prasečí pankreatickou lipázu,  GEH = glycerolesterhydroláza  se příliš nepoužívá (Google 4 690). Frekventovanější je označení LPS (Google 51 000), někdy se používá  HPL = lidská pankreatická lipáza (Google 7 910).

 

Preanalytická fáze

Při stanovení v séru je stabilita: 7 dnů při 20 - 25 °C, 7 – 21 dnů při 4 - 8 °C, 1 rok při -20 °C.

Nesmí se použít zkumavka s přídavkem EDTA; nestanovovat v plazmě. Plazma obsahuje kromě pankreatické lipázy také další enzymy s lipolytickou aktivitou: žaludeční, jazykovou a jaterní lipázu, intestinální lipázu (z duodenální sliznice) a lipoproteinovou lipázu, EC 3.1.1.34. V plazmě se nachází také aliesteráza (karboxylesteráza, EC 3.1.1.1.), která štěpí estery glycerolu s krátkými mastnými kyselinami a arylesteráza (EC 3.1.1.2) štěpící estery fenolu. Všechny tyto enzymy mohou  interferovat při stanovení aktivity pankreatické lipázy při použití nedostatečně specifických metod.

Hemolýza ( hemoglobin ≥ 2,5 g/l) ruší stanovení; renální insuficience a opiáty zvyšují aktivitu lipázy. Je třeba se vyhnout opakovanému zamrazení vzorku.

 

Popis metody

Lipáza EC 3.1.1.3 je glykoprotein, má alespoň 2 izoformy a molekulovou hmotnost 38000 – 59000; poločas vymizení  7 – 14 h.

 

Titrace uvolněných mastných kyselin:

 

reakce3

 

Volné mastné kyseliny se buď titrují roztokem hydroxidu sodného na barevný indikátor fenolftalein (Cherry-Crandallova metoda) případně metylčerveň, nebo se k detekci používá velmi citlivého pH-metru (±0,01 jednotky).

 

Imunochemická stanovení:

a) Imunoaktivace

RIA po kompetici radioaktivně značené lipázy a lipázy ze vzorku o substrát.

Při nekompetitivní enzymové imunoanalýze jsou Fab fragmenty protilátky proti pankreatické lipáze kovalentně navázány na křenovou peroxidázu. V přítomnosti lipázy dochází k vývoji zbarvení, jehož nárůst je úměrný koncentraci lipázy ve vzorku.

b) Latexová aglutinace

Latexové kuličky potažené protilátkou proti lipáze agregují, je-li přítomna lipáza v dostatečnémmnožství.

 

Enzymová kaskáda – postup A:

 

reakce1

 

Enzymová kaskáda – postup B:

 

reakce2

 

Glycerol se stanovuje některou z enzymových reakcí používaných při stanovení triacylglycerolů.

 

Fotometrická detekce:

Ester 1,2-O-dilauryl-glycero-3-glutarové kyseliny a 4-metylresorufinu se štěpí na nestabilní ester s kyselinou glutarovou a dále na barevný 4-metylresorufin.

 

 

Vyčeření emulze:

Turbidimetricky nebo nefelometricky se sleduje pokles velikosti koloidních částic emulze v důsledku působení lipázy. Metoda se často používá.

 

Spektrofotometrická metoda stanovení lipázy v séru

Činidla

  1. Absolutní etanol, p.a.
  2. Kyselina sírová (0,14 mol/l). K 500 ml destilované vody se přidají 4 ml  koncentrované kyseliny sírové. Roztok je stabilní 1 rok za laboratorní teploty.
  3. Směs kyseliny a alkoholu připravovaná denně čerstvá. Ke dvěma dílům H2SO4 (0,14 mol/l) se přidají 3 díly absolutního etanolu.
  4. Petroleter frakce 30° – 60° C, redestilovaný.
  5. Metylčerveň 2 g/l.  Rozpustit 200 mg práškové metylčerveně v 100 ml 95% etanolu, což trvá alespoň 12 h na magnetické míchačce. Roztok je stabilní 6 měsíců za laboratorní teploty. 
  6. Olivový olej, p.a. Olivový olej se oddělí od mastných kyselin přes kolonu oxidu hlinitého   (zrnitost 80-200 mesh) nebo pomocí trubky s napěchovanou skleněnou vatou. Jeden díl oleje je čistěn jedním dílem Al2O3. Obsah mastných kyselin v oleji se kontroluje napipetováním 50 µl oleje do 3 ml činidla obsahující metylčerveň, po protřepání a centrifugaci. Je-li absorbance při 502 nm  ve vrstvě metylčerveně > 0,02 v 10 mm  kyvetě, olej musí procházet přes větší množství Al2O3. Olej je stabilní alespoň 1 týden při 4° až 8° C.
  7. Substrát/pufr (5 % suspenze triacyglycerolů). 5 ml čistěného oleje se homogenizuje ve vysokorychlostním mixéru s 95 ml pufru. Používá se opakované krátkodobé míchání (30 až 60 s) s následným krátkým chlazením, aby se předešlo přehřátí a hydrolýze oleje. Mixování se pokračuje, až se po usazení pěny neobjeví žádný olejový film. Nastaví se pH 8,5 při 25° C přidáním 1 M HCl nebo NaOH. Skladujte při 4° až 6° C. Zdvojnásobení hodnoty blanku indikuje nutnost přípravy čerstvého činidla substrát/pufr.
  8. Pufr. Postupně rozpustit 2,42 g (0,02 mol) of tris(hydroxymetyl)aminometanu, 3,5 g (8,9 mmol) deoxycholové kyseliny a 0,2 g (1,1 mmol) kyseliny askorbové v 500 ml destilované vody v 1 l odměrné baňce a doplnit objem destilovanou vodou. Stabilní 2 měsíce při 4° až 8° C.
  9. Octan sodný, 1 mol/l. Rozpustit 13,6 g trihydrátu octanu sodného do konečného objemu 100 ml destilované vody. Stabilní za laboratorní teploty 2 měsíce.
  10. Činidlo metylčerveň. Toto činidlo se připravuje, aby se korigovaly rozdíly mezi jednotlivými šaržemi barviva. K 1 l 95 % etanolu se přidá 10 ml 1 M NaOH. Přidá se dostatečné množství roztoku metylčerveně (2 g/l) obvykle 10 až 13 ml, aby se dosáhla absorbance 0,095 až 0,100 v 10 mm kyvetě při 502 nm. Pak se přidá 1 ml 1 M octanu sodného a zamíchá magnetickou míchačkou. Po kapkách se přidává 1 N HCl pokud přetrvává nejasný oranžově-červený odstín. Opatrně přidávejte další kyselinu, dokud roztok nedosáhne v 10 mm kyvetě absorbance 0,200 ± 0,005.  If this point is passed, the solution must be back-titrated with dilute NaOH. Vyhněte se nadbytečnému ředění tohoto činidla. Činidlo je stabilní při skladování v tmavé láhvi 1 měsíc při laboratorní teplotě.
  11. Roztok standardu: kyselina stearová (1 mmol/l). Rozpustit 28,5 mg kyseliny stearové ve 100 ml heptanu nebo petroleteru. Odměří se 0,25, 0,50 a 0,75 ml do zkumavek se šroubovacím závěrem a suší při 50° až 60° C na vodní lázni s mírným proudem vzduchu. Tyto standardy obsahují 0,25, 0,50 a 0,75 µmol mastné kyseliny. Lze připravit několik sad standardů současně, protože odparky jsou v utěsněných zkumavkách stabilní týdny při teplotě 4° až 8° C.
  12. Sušící aparatura. Toto zařízení urychlující odpařování lze vyrobit z tenkostěnné kovové nebo pevné plastové 10 cm dlouhé trubky, která je upevněna do dna malé plastové krabice. Krabice je pak naplněna skleněnou vatou. Tlakový vzduch je vháněn do krabice tak, aby se dostával do trubek s petroleterem (lze upevnit více trubek současně). Odpařování lze urychlit umístěním zkumavek do vodní lázně s teplotou 50° až 60° C.

 

Postup měření

Přístrojové vybavení: Spektrofotometr se šířkou pásma ≤ 10 nm, vlnová délka 502 nm, kyveta inkubovaná na 37° C.

  1. Předehřát sérum a substrát 5 min při 37° C (vodní lázeň).
  2. Pipetovat 1 ml substrátu a 50 µl séra do dvou skleněných zkumavek se šroubovatelným víčkem, zamíchat a uzavřít.
  3. Inkubace 30 min.
  4. Do obou zkumavek odměřit 3,3 ml směsi kyseliny s alkoholem.
  5. Do třetí zkumavky pipetovat 1 ml substrátu, přidat 3,3 ml směsi kyseliny s alkoholem a 50 µl séra jako sérový blank.
  6. Do čtvrté zkumavky pipetovat pipetovat 1 ml substrátu a 3,3 ml směsi kyseliny s alkoholem jako reagenční blank.
  7. Do všch zkumavek napipetovat 4 ml petroleteru.
  8. Všechny zkumavky utěsnit, intenzivně míchat a centrifugovat při 2000 ot/min (přibližně 500 g) 5 min.
  9. Odtáhnout 2,0 ml z horní vrstvy petroleteru u každé zkumavky a přemístit do jiných skleněných zkumavek se šroubovatelným víčkem.
  10. Odpařit petroleter.
  11. Přidat 3 ml činidla s metylčervení k olejovému zbytku vzorku a vysušených standardů. Uzavřít zkumavky teflonovými víčky a intenzivně míchat 1 min.   Cap the tubes with Teflon-lined caps, and shake vigorously for 1 min. Centrifugovat při 2000 ot/min (přibližně 500 g), aby se odstranil rozptýlený olej.
  12. Dekantovat supernatant a měřit v kyvetě s optickou dráhou 10 mm ve spektropfotometru  při 502 nm.
  13. Je-li absorbance vzorku vyšší než u nejvyššího standardu, vzorek se ředí 1:1 činidlem s metylčervení.

 

Výpočet

Do diagramu se vynesou absorbance standardů a reagenčního blanku proti µmol mastných kyselin. Stanoví se množství mastné kyseliny vwe vzorcích a blancích podle naměřených absorbancí vzhledem ke standardní křivce a pak se použije následující vzorec:

 

 (µmoly vzorku – µmoly sérového blanku) x ředění x extrakční objem              uvolněné mastné

                                odpařený objem x objem séra                                          kyseliny [mmol/l séra]

 

nebo

 

uvolněná mastná kyselina bez blanku  x  ředění  x  2 x  20  /  60  =  µkat/l lipázy

 

Poznámka:

Aktivita lyofilizovaného séra kolísá < 5 % během 1 roku.

 

Turbidimetrická metoda stanovení lipázy v séru

Vyčeření emulze olivového oleje je měřeno turbidimetricky při 340 nm.

 

Činidla

  1. Tris-deoxycholátový pufr. Rozpustit 3,0 g (0,025 mol) tris(hydroxymetyl)aminometanu a 6,0 g (0,014 mol) deoxycholátu sodného v destilované vodě a naředit na konečný objem 1 litr. Nastavit na pH 8,8 koncentrovanou HCl. Stabilita 6 měsíců při 4° až 8° C.
  2. Olivový olej, p.a. Olivový olej se oddělí od mastných kyselin přes kolonu oxidu hlinitého   (zrnitost 80-200 mesh) nebo pomocí trubky s napěchovanou skleněnou vatou. Jeden díl oleje je čistěn jedním dílem Al2O3. Obsah mastných kyselin v oleji se kontroluje napipetováním 50 µl oleje do 3 ml činidla obsahující metylčerveň, po protřepání a centrifugaci. Je-li absorbance při 502 nm  ve vrstvě metylčerveně > 0,02 v 10 mm  kyvetě, olej musí procházet přes větší množství Al2O3. Olej je stabilní alespoň 1 týden při 4° až 8° C.
  3. Emulze olivového oleje. Rozpustit 1,0 g čistěného olivového oleje v 100 ml absolutního etanolu. Přidat 4 ml tohoto roztoku pomalu za současného míchání k 100 ml Tris-deoxycholátového pufru. Absorbance tohoto činidla při 340 nm by měla být nastavena přidáním dalšího Tris-deoxycholátového pufru tak, aby byla uvnitř rozsahu měření fotometru.
  4. Standard. Lyofilizované sérum se známou aktivitou lipázy.

 

Postup měření

Přístrojové vybavení: Spektrofotometr se šířkou pásma ≤ 10 nm, kyveta inkubovaná na 37° C.

  1. K 1 ml emulze se přidá50 µL vzorku, standardu nebo kontrolního materiálu. Ihned se zamíchá.
  2. V každé zkumavce se měří absorbance při 340 nm po 1 min (A1´) a podruhé po 5 min (A5´).

 

Výpočet

 

                        (A1' – A5')vzorku x aktivitastandardu / (A1' – A5')standardu  =  aktivitavzorku

                              

 

Poznámky k analytické metodě

Zásadní poznatek pro pochopení metodologie stanovení lipázy je to, že enzym působí pouze na rozhraní mezi esterem a vodou. Tedy substrát musí být ve formě emulze. Reakční rychlost stoupá, je-li emulze více dispergována – tedy plocha rozhraní je větší. Neschopnost získat vhodné rozhraní mezi esterem a vodou umožňuje, aby se uplatnily jiné enzymy jako karboxylová ester hydroláza, arylester hydroláza a lipoproteinová lipáza. Jsou-li používány triacylglycerolové substráty s krátkými řetězci mastných kyselin, které jsou ve vodě rozpustné, mohou se také uplatnit výše uvedené enzymy jako falešná lipázová reakce.

 

První titrační metody byly příliš zdlouhavé (24 h  inkubace séra při 37 °C s 50 % emulzí olivového oleje a 5 % arabskou gumou ve fosfátovém pufru při pH 7,0; uvolněné mastné kyseliny byly titrovány 50 mmol/l NaOH na fenolftalein).

Detekce byla možná i za 1 h, jestliže se uvolněné mastné kyseliny extrahovaly (detekce na metylčerveň). Jedna z variant tohoto postupu je uvedena jako doporučená metoda.

Podstatně rychlejší je využití pH‑metru k detekci ukončení titrace (pH-stat); rozsah metody do 76,1 µkat/l, reprodukovatelnost v sérii CV 1,8 – 5,5 %, mezi dny 1,9 – 6,4 %.

Nebo se sleduje rychlost změny pH vlivem uvolněných mastných kyselin (detekce změny pH 0,02 – jako substrát je olivový olej a doba analýzy je 3 min).

 

Imunochemické metody stanovují lipázu buď kvantitativně (enzymová imunoanalýza) nebo semikvantitativně (latexová aglutinace), kdy je protilátka vázaná na latexové částice, které reagují se vzorkem.

Při nekompetitivní enzymové imunoanalýze (ELISA) jsou Fab fragmenty protilátky proti pankreatické lipáze kovalentně navázány na křenovou peroxidázu. V přítomnosti lipázy dochází  k vazbě na kotvící specifickou protilátku a poté k vazbě konjugátu na lipázu. S tetrametylbenzidinem dochází k vývoji zbarvení, jehož nárůst je úměrný koncentraci lipázy ve vzorku. Vertikální fotometrie se provádí při 450 nm. Mez detekce je 0,017 µkat/l. Přesnost v sérii je CV 4,9 %, mezi sériemi 5 – 9 %.

 

Enzymová kaskáda používá 1,2-diglycerid mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, rozpouštějící micely, obsažený ve vaječném lecitinu. Lipáza štěpí tento substrát na 2-monoglycerid a mastnou kyselinu. Reakční směs je pufrována na pH 6,8 (N-morfolino)etansulfonovou kyselinou/N,N-bis(2-hydroxyetyl)-2-aminoetansulfonovou kyselinou. V dalším kroku je 2-monoglycerid hydrolyzován na glycerol specifickou 2-monoglycerid lipázou a je pufrována na pH 8,0 3-[tris(hydroxymetyl)metylaminopropan-sulfonovou kyselinou. V posledním kroku je chromogen (4-aminofenazon/N-etyl-N-[2-hydroxy-3-sulfopropyl-m-toluidin] [TOOS]) oxidován na fialové barvivo s maximem absorbance 550 nm. Reakční směs také obsahuje kolipázu, deoxycholát a vápenaté ionty. Postup má dobrou reprodukovatelnost a je snadno automatizovatelný. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 0,29 – 2,57 %, celková reprodukovatelnost 1,30 – 3,44 %.

Odlišný postup byl použit při technologii suchého filmu. Zde byl 1-oleyl-2,3-diacetoylglycerol adsorbovaný na částice oxidu titaničitého. Tyto částice poskytly povrch potřebný pro vznik aktivity lipázy. Pro zvýšení aktivity lipázy jsou také přítomny emulgátor a prasečí kolipáza. Lipáza působí na asymetrický triacylglycerol tak, že se uvolňuje kyselina olejová a diacetoylglycerol, který je rozpustný ve vodě. Diacetoylglycerol difunduje do další vrstvy filmu, kde esteráza odštěpí obě acetátové skupiny a uvolní se glycerol, který je pak kvantifikován enzymovou metodou. Když se nechá určitá prodleva před měřením, tak se endogenní glycerol (mohou jej obsahovat některá léčiva) spotřebuje a neinterferuje při analýze.

Při fotometrickém stanovení lze také pracovat pouze s jediným enzymem – pankreatickou lipázou, který hydrolyzuje v přítomnosti laurylsíranu sodného a fenylmetylsulfonylfluoridu 2,3-dimerkapto-1-propanol tributyrát na 2,3-dimerkapto-1-propanol a kyselinu máselnou. Uvolněný 2,3-dimerkapto-1-propanol reaguje s 5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoovou kyselinou) za vzniku žlutého thio-2-nitrobenzoátu, který se detekuje při 412 nm. Reprodukovatelnost v sérii CV < 5 %.

Jiný umělý substrát je ester 1,2-O-dilauryl-glycero-3-glutarová kyseliny a 4-metylresorufinu. Po štěpení lipázou vzniká nestabilní ester dikarboxylové kyseliny, který se spontánně hydrolyzuje na žlutou kyselinu glutarovou a modro-purpurový 4-metylresorufin s absorpčním maximem 580 nm. Kinetika vzniku metylresorufinu je přímo úměrná aktivitě lipázy. K dosažení optimální reaktivity a specifity se přidávají soli žlučových kyselin, kolipáza a chlorid vápenatý. Celková reprodukovatelnost stanovení je CV 5,7% až 9,6%.

 

Vyčeření je postup při kterém se sleduje snížení zákalu emulze oleje s vodou při 340 nebo 400 nm v důsledku hydrolýzy triacylglycerolů lipázou. Tato technika vyžaduje vysoce stabilní a reprodukovatelně připravovaný substrát, který má vhodnou počáteční absorbanci. Vzorek se přidá k substrátu a kinetika vyčeření se měří turbidimetricky nebo nefelometricky.        Kolipáza zvyšuje reakční rychlost a spolu s přídavkem žlučových kyselin zvyšuje spolehlivost analýzy. Metoda je rychlá a snadno automatizovatelná. Koncentrace substrátu je ovšem daleko pod úrovni konstanty Michaelise a Mentenové a proto nebyl tento postup navržen ke standardizaci. Vysoké hodnoty revmatoidního faktoru ruší stanovení. Mez detekce 0,09 µkat/l. Rozsah metody do 4,7 µkat/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 9,3 – 10,9 %, mezi sériemi 13 – 14 %.

 

Fluorimetrická detekce je založena na hydrolýze esteru kyseliny olejové se 4-metyl-umbeliferonem prostřednictvím lipázy. Uvolněný 4-metylumbeliferon se detekuje fluorimetrem. Reprodukovatelnost měření CV 6,2 – 15,5 %; výtěžnost 98 – 102 %.

 

Nový typ techniky stanovení pankreatické lipázy je založen na změně vodivosti roztoku uvolněním mastných kyselin ze substrátu-trioleinu; detekce se provádí akustickým snímačem a měřenou veličinou je frekvenční odpověď.

 

Intraindivuduální variace 14 %, interindividuální variace 17 %.

Senzitivita 98,1 %, specificita 81 %.

 

Referenční metoda nebyla ustanovena.

V roce 2003 byly připraveny dva certifikované referenční materiály a to z lidské pankreatické šťávy pod označením BCR 693 (Bureau Communitaire de Référence) a rekombinantní technologii pod označením BCR 694. Oba materiály mají stejné katalytické vlastnosti a stabilitu.

 

Toleranční limit EHK: 24 %.

 

Interference

Výsledky stanovení lipázy zvyšují: acetaminofen, albumin, betanechol, bilirubin, cerivastatin, deoxycholát, diazoxid, didanosin, dideoxyinosin, dipidolor, estropipat, etanol, felbamat, fentanyl, hemodialýza, heparin, hydrokortizon, chlorothiazid, cholinergika, kalcitriol, klozapin, kodein, kyselina valproová, meperidin, merkaptopurin, metacholin, metolazon,  metronidazol, minocyklin, morfin, nitrofurantoin, orální kontraceptiva, pegaspargasa, pentazocin, peritoneální dialýza, prednisolon, sekretin, spasmoveralgin, sulfamethoxazol, aj.

Výsledky stanovení lipázy snižují: citronan, EDTA, hemoglobin, oxalát, revmatoidní faktor (turbidimetrie, nefelometrie), těhotenství, aj.

 

 

Další informace

Principy analytických postupů

 

 

Petr Štern, 2011-02-28