Stanovení karbamazepinu
Synonyma
CBZ, APO-Carbamazepine, carbamazepinum, Biston, Calepsin, Carbategral, Carbatrol, Carbazep, Convulsine, Epitol, Equetro, Finlepsin, Hermolepsin, Karbamazepine, Lexin, Mazepine, Neuritol, Neurotol, Neurotop, Nordotol, Servimazepine, Sirtal, Stazepine, Tegretal, Tegretol, Tegretol XR, Telesmin, Temporol, Teril, Timonil, Trimonil Retard 5H-dibenzo[b,f]azepin-5-karboxamid, 5-karbamoyl-5H-dibenz[b,f]azepin Preanalytická fáze
Stanovení
se provádí v séru, případně v plazmě (koagulant EDTA, heparin).
V plazmě jsou výsledky vyšší než v séru. Odběr se obvykle provádí
před následující aplikací.
Stabilita
vzorku: 20 – 25 °C: plazma, sérum 2 dny; 4 – 8 °C: plazma 10 dnů, sérum 7 dnů;
-20 °C: plazma 8 týdnů, sérum 4 týdny.
Karbamazepin
se může vázat na separační gely. Hemolýza ruší při analýze.
Poznámky k
analytické metodě
Ke stanovení karbamazepinu se používá především
kompetitivních imunoanalytických metod, dále spektrofotometrie v UV i
viditelné oblasti, fluorimetrie, TLC, GC a HPLC.
UV spektrometrie má pouze historický význam. Vzorky se po extrakci
měřily při 290 nm, protože při maximu absorbance karbamazepinu 215 -220 nm byly
četné interference jiných antikonvulsiv. Přidáním kyseliny chlorovodíkové se
azepinový kruh změnil na 9-metylakridin
a maximum 290 nm se posunulo na 255 nm, přičemž se citlivost analýzy
zvýšila. Extrakce je pracná a metoda není dostatečně specifická.
Podobně je tomu při detekci ve viditelné oblasti. Karbamazepin se
extrahuje do dichloretanu při neutrálním pH. Extrakt reaguje s dusitanem
sodným a kyselinou dusičnou za vzniku žluté rozpustné sloučeniny, jejíž
absorbance se měří při 400 nm.
Fluorimetrická detekce může následovat po rozdělení na tenké vrstvě.
Tento postup je pracný a vyžaduje zkušenosti, jinak jsou výsledky nepřesné.
Imunoanalýzy jsou velmi snadné a vhodné pro měření karbamazepinu
v terapeutickém intervalu. Nicméně u pacientů s nevhodnou odezvou
nebo při toxickém účinku je užitečné používat metody, které také stanovují
metabolity karbamazepinu.
Kompetitivní EMIT využívá soutěže karbamazepinu ze vzorku a
konjugátu karbamazepinu s glukóza-6-fosfátdehydrogenázou a vazebná místa
na protilátce. Enzymová značka je v imunokomplexu inhibována. Čím více
léčiva je ve vzorky, tím méně konjugátu se naváže a měřená aktivita enzymu bude
vyšší. Metoda je běžně dostupná, ale neumožňuje zvlášť měřit množství epoxidu.
Reakční čas 45 s. Linearita 2 – 20 mg/l.
Reprodukovatelnost 8 – 10 %. Ruší hemolýza.
Homogenní fluorescenční imunoanalýza se substrátovým markerem používá
v kompetitivní reakci jako konjugát karbamazepin s navázaným
galaktosylumbeliferonem. Po vytvoření imunokomplexu s protilátkou je ze
stérických důvodů konjugát nepřístupný pro následné štěpení
β-galaktosidázou. Volný konjugát se štěpí a vzniklý umbeliferon se sleduje
fluorimetricky. Signál je přímo úměrný koncentraci léčiva. Metoda není běžně
používaná.
FPIA využívá kompetice
mezi léčivem ze vzorku a léčivem označeným derivátem fluoresceinu o vazebná
místa na protilátce. V imunokomplexu má fluorescein omezenou pohyblivost a
vyšší emisi polarizovaného světla. Množství konjugátu v imunokomplexu je
tím nižší, čím je více léčiva ve vzorku, tedy měřený signál je nepřímo úměrný
koncentraci karbamazepinu ve vzorku. Reakční čas je 10 min. Mez detekce 0,5 mg/l. Linearita 2 – 20 mg/l. Reprodukovatelnost
4 % v terapeutickém intervalu.
TLC je kvalitativní
metoda pro detekci karbamazepinu a jeho metabolitů. Po separaci se chromatogram
nechá reagovat se 70 % kyselinou chloristou a poté se zahřeje. Tím je umožněna
fluorescenční detekce s excitací při 358 nm a emisí při 498 nm. Pro
vyvolání fluorescence lze také použít síran ceričitoamonný a kyselinu
fosforečnou. Další možností je použití par kyseliny dusičné.
Plynová chromatografie byla dříve široce
používaná. Starší techniky používaly derivatizace, novější postupy mají kolony
s deaktivační náplní, které nevyžadují derivatizaci k dosažení
dobrého rozlišení. Metoda obvykle začíná extrakcí karbamazepinu
z fosfátového pufru do směsi benzen-octan etylnatý 4:1 a následným
rozpuštěním odparku extraktu v metanolu. Většina GLC metod stanovuje pouze
původní léčivo, ale některé kromě toho měří i metabolit epoxid karbamazepinu (metabolit je nestabilní a výsledky jsou
nepředvídatelné ať už se použije plameno-ionizační nebo hmotnostní detektor).
K dalšímu zvýšení citlivosti metody se používá kombinace GC-MS (mez
detekce v řádu 10-9). Ačkoliv GLC je dostatečně citlivá,
problémem zůstává rozklad karbamazepinu v důsledku vysoké teploty kolony
(200 – 260 °C). Derivatizací lze tyto obtíže minimalizovat. Přídavek vnitřního
standardu s podobnou chemickou strukturou zvyšuje přesnost měření. Nové
kolony s deaktivační náplní umožňují stanovení karbamazepinu bez
derivatizace a omezují vznik rozkladných produktů. Reprodukovatelnost je
v sérii CV 1,9 %, mezi dny 4 % při koncentraci 33,84 µmol/l; výtěžnost
dosahuje 89 %.
HPLC stanovuje
karbamazepin i jeho epoxid a zmenšuje obtíže související s teplotní
nestabilitou (teplota kolony je
Většina prací uvádí dobrou korelaci mezi EMIT, FPIA, GLC a HPLC pokud
nejsou v séru pacienta také metabolity karbamazepinu.
Podle údajů College of American Pathologists z roku
2001 se CV pro karbamazepin pohybuje v intervalu 4 – 12 % při stanovení
koncentrace 25,38 µmol/l. Přípustná chyba pro výsledky (CLIA-88) je ±25%.
Požadovaná přesnost, která je odvozena z biologické variability uvažuje
vychýlení ±6,25 % při koncentraci 33,84 µmol/l a ±6,42 % při koncentraci 50,76
µmol/l.
Karbamazepin je uveden v katalogu amerických
farmaceutických referenčních standardů jako Carbamazepine 1093001, který má
deklarovanou čistotu 99,9 %.
Toleranční limit EHK: 24 %.
Interference
Výsledky stanovení karbamazepinu snižují: fenobarbital, fenytoin,
hemoglobin 4 g/l (-10 %), cholesterol 12,7 mmol/l (-10 %), lipémie (intralipid
1,25 g/l), primidon, triacylglyceroly 4,3 mmol/l (-10 %), aj.
Výsledky stanovení karbamazepinu v séru zvyšují: bilirubin > 170
µmol/l, cimetidin, danazol,
erythromycin, fluoxetin, isoniazid,
karbamazepin-10,11-epoxid (+20 až +25 % všechny imunoanalýzy), kyselina
valproová, lipémie (intralipid 5 g/l), lithium, nikotinamid, propoxyfen,
stiripentol, triacetyloleandomycin, tricyklická antidepresiva (imunoanalýzy),
verapamil, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-03-02