Stanovení kyseliny močové
Synonyma
Urát, 8-hydroxyxantin, purin-2,6,8-triol, purin-2,6,8(1H,3H,9H)-trion,
2,6,8-trioxypurin, 2,6,8-trioxopurin, 2,6,8‑trihydroxypurin,
uric acid, uric oxide, lithic acid
7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion
Preanalytická fáze
Stanovení se
provádí v plazmě, séru a moči. Výsledky v plazmě jsou v průměru o 11,8 µmol/l vyšší než
v séru. Při analýze plazmy se jako
antikoagulant nesmí používat EDTA, citrát ani oxalát (inhibují urikázu
používanou při enzymatickém fotometrickém stanovení - způsobují falešně nižší
výsledky); tento enzym je dále inhibován fluoridem sodným, kyanidem a
formaldehydem. Lze použít heparinát lithný. Opakované zamrazení vzorku
nevadí. Hemolýza neruší při enzymové metodě
do koncentrace hemoglobinu 3,5 g/l, ruší ikterus.
Moče je nutné
upravit na hodnotu pH > 8,0. Vzorek moče je nutné alkalizovat, aby
nevykrystalovaly uráty. Takto upravená moč je stabilní za laboratorní teploty 3
dny.
Stabilita sérum: 3 dny při 18 - 26 °C, 3 – 7 dní při 2 - 8 °C, 6 – 12 měsíců při
-20°C.
Stabilita moč: 3 – 4 dny při 18 - 26 °C, 1 týden při 2 - 8 °C, 4 týdny při -20°C.
Stanovení
ovlivňuje fyzická zátěž, věk, nadmořská výška a dieta.
Poznámky k analytické metodě
První analytickou metodou byla redukce fosfowolframové kyseliny na
wolframovou modř (fotometrie při 650 až 700 nm) v alkalickém prostředí
uhličitanu vápenatého (1912), přičemž kyselina močová se oxidovala na
allantoin. Bílkoviny bylo nutné předem vysrážet a kyselinu močovou
z filtrátu izolovat jako stříbrnou sůl. Metoda byla dále upravována tak,
že se izolovala hořečnatá, amonná, mědná nebo mědnatá sůl. Použití kyanidu
zvýšilo citlivost metody, stabilizovalo konečné zbarvení reakčního produktu a
eliminovalo potřebu izolace kyseliny močové z filtrátu. Precipitace bílkovin
se prováděla wolframovou, trichloroctovou nebo fosfowolframovou kyselinou,
teplem nebo filtrací přes membránu. Jiná oxidační činidla obsahovala
arsenowolframovou, arsenofosfowolframovou, arsenomolybdenovou kyselinu,
ferrikyanid draselný nebo uranyl acetát. Ke zlepšení specifity oxidace byla
kyselina močová adsorbována na iontově-výměnné koloně a N-etylmaleimid se
přidal, aby se vyloučila interference chromogenů obsahujících sulfhydrylovou
skupinu.
Použití urikázy
významně zvýšilo specifitu metody. Tato metoda je založena na oxidaci kyseliny
močové urikázou na allantoin a peroxid vodíku. Allantoin, na rozdíl od kyseliny
močové, neabsorbuje při 290 – 293 nm (pH ≥ 7), resp. 283 nm (pH < 7). Fotometrické
měření se provádělo před a po působení urikázy. The Centers for Disease
Control navrhlo jako referenční metodu pro stanovení v séru: vysrážení bílkovin
kyselinou trichloroctovou, aby se eliminoval vysoký blank. Následně se
sledovala E.P. oxidace kyseliny močové bakteriální urikázou o vysoké čistotě
jako pokles absorbance při 283 nm. Preciznost se pohybovala od 2,6 % (177
µmol/l) do 1,5 % (584 µmol/l). Metoda je lineární do 1180 µmol/l. Výtěžnost je
od 99 do 101 %. Významnější interference se projevovala pouze u guaninu a
xanthinu. Malé interference také způsobuje EDTA a NaF. Reakci lze provádět jak
v režimu E.P., tak kineticky.
Je možné také
kvantifikovat vzniklý peroxid vodíku po reakci s o-dianisidinem při 530
nm. Jiným příkladem je reakce peroxidu vodíku s 3-metyl-2-benzothiazolinonem a
N,N-dimetylanilinem v přítomnosti peroxidázy, kdy vzniká modré indaminové
barvivo, jehož absorbance se měří při 600 nm.
Peroxid vodíku
také reaguje s 3,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonovou kyselinou a
4-aminofenazonem v přítomnosti peroxidázy za vzniku červeného
chinoniminového barviva, jehož absorbance se měří při 520 nm, aby se eliminoval
vliv hemolýzy, bilirubinu a zákalu. Reakce má dobrou reprodukovatelnost.
Interference bilirubinu je eliminována přidáním ferrikyanidu draselného.
Askorbát oxidáza zabraňuje interferenci kyseliny askorbové.
2,4,6-Tribromfenol
lze také použít k reakci se 4-aminofenazonem, kdy se absorbance produktu
měří při 492 nm.
Jestliže se jako
akceptor kyslíku použije 3,7-diamin-5-fenothiazin thioninový derivát lze provádět
měření při 600 nm, kdy neruší hyperbilirubinémie.
Další barevnou
reakcí je využití formaldehydu (Kageyamova metoda), který vzniká
z peroxidu vodíku a metanolu za katalýzy enzymem katalázou. Formaldehyd
reaguje s acetylacetonem a amoniakem za vzniku žlutého
3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidinu, který se měří při 410 nm.
Peroxid vodíku také může za působení katalázy reagovat s etanolem
na acetaldehyd, který se oxiduje na acetát pomocí NAD+ a při 340
nm se sleduje vznik redukovaného
NADH.
Reflexní fotometrie používá
celulózovou matrici obsahující urikázu, peroxidázu a kyslíkový receptor
3-metyl-2-benzthiazolinonhydrazon hydrochlorid
(MBTH). Kyselina askorbová při reakci ruší, proto je třeba sérum naředit.
Urikázu a peroxidázu lze použít i s 3,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonovou kyselinou a 4-aminofenazonem, kdy vzniká červené chinoniminové barvivo.
Třetí typ proužků opět používá urikázu a peroxidázu avšak s
2,4,6-tribromfenolem a 4‑aminofenazonem.
Koncentrace kyseliny močové v séru nebo moči je úměrná rychlosti
spotřeby kyslíku při urikázou katalyzované oxidaci a může být měřena Clarkovou
polarografickou elektrodou.
Coulometrická titrace měří v séru celkové množství látek
redukovaných jodem před a po reakci s urikázou. Vhodná instrumentace není
běžně dostupná. Metoda má SD ±5,39 µmol/l v intervalu 142 – 684 µmol/l a
výtěžnost 98,2 – 100,3 %.
HPLC pro stanovení
v séru nebo moči používají buď reverzní fáze a detekce při 235 nebo 280
nebo 293 nm, případně separace na ionexu a ampérometrické měření v elektrochemickém
detektoru. Citlivost ampérometrického detektoru je 5,9 µmol/l. Interferují
pouze metabolity teofylinu‚ metylmočová kyselina). Reprodukovatelnost mezi dny
je CV 1 – 2 %. Metoda je lineární v rozsahu 59 – 1180 µmol/l.
Referenční (definitivní) metodou je izotopová diluce s hmotnostní
spektrometrií uvedená National Institute of Standards and Technology
v roce 1990. Známá navážka [1,3-15N2] kyseliny
močové byla přidána k navážce séru. Po promíchání se směs nanesla na
anexovou pryskyřici a izolovaná kyselina močová se převedla na
tetrakis(terc.butyldimethylsilyl) derivát. Ten se nastříknul do plynového
chromatografu s nízkou rozlišitelností a prošel do magnetického sektoru
hmotnostního spektrometru. Sledovalo se zastoupení [M-terc.butyl]+
iontů
V současnosti laboratoře používají výhradně urikázové metody. Doporučené jsou enzymové metody kromě postupu
podle Kageyamy.
Certifikovaný referenční materiál nese označení
SRM 909 a,b (Level 1, Level 2) NIST, USA.
College of
American Pathologists v roce 2001 požadovala preciznost pro urikázovou
metodu < 3 % při koncentraci kyseliny močové 295 µmol/l. Akceptovatelná
přesnost (CLIA-88) je ±17%.
Intraindividuální variace pro kyselinu močovou v krvi je přibližně 9 %.
Analytická preciznost odvozená ze studie biologické variace musí být 4,3 %, aby
celková chyba nebyla větší než 12 %.
Toleranční limit EHK SEKK: sérum 14 %, moč 26 %; CV pro vnitřní kontrolu
kvality: 6 %, teoretický toleranční limit: 13,8 %.
Interference
Koncentraci kyseliny močové v séru nebo
plazmě snižují: alanin, albuterol, aldakton, allopurinol, amiclaran, aspirin,
azathioprin, azlocillin, bilirubin > 85,5 µmol/l, benzbromaron, benziodaron,
cefotaxim, citrát (-22 %), dikumarol, dipyron, dobutamin, EDTA (‑11 %),
fenylbutazon (vysoké dávky), fluoridy (-22 %), formaldehyd, griseofulvin,
hemodialýza, hemoglobin, hydrochlorothiazid, chlorothiazid, chlorpromazin,
chlorprothixen, indometacin, kanolový olej, klofibrát, kontraceptiva,
kortikosteroidy, kortikotropin, kouření, kyanidy, lipémie (až -13 %),
metotrexát, oxyfenbutazon, prednisolon, probenecid, radiografická činidla,
spironolakton, těhotenství (do 16. týdne), vegetariánská dieta, verapamil, vitamin
C, xantin (až -40 %), aj.
Koncentraci kyseliny močové v séru nebo
plazmě zvyšují: acetaminofen, acetazolamid, acetoacetát, adrenalin, aldatense,
aldesleukin, p-aminofenol, aminothiadiazol, ampicillin, anabolické steroidy,
angiotensin, aspirin, atenolol, azathioprin, azathymin, azauridin, basiliximab,
bendroflumethiazid, benetazon, bisoprolol, bumetanid, busulfan, capreomycin,
cis-platina, cvičení, cyklosporin, cystein, cystin, cytarabin, defibrotid,
diapamid, diazoxid, dichlorfenamid, didanosin, dideoxyinosin, dithiazem,
dopamin, doxorubicin, edecrin, ergothionin, etanol, ethakrynová kyselina,
ethambutol, etoposid, fenylbutazon (nízké dávky), fruktóza, furanthril,
furantral, furosemid, hladovění, hydrochlorothiazid, hydroxymáselná kyselina, hydroxyurea, hypoxantin, chlorambucil,
chlormethin, chloroform, ibuprofen, indapamid, kalcitriol, kancerostatika,
káva, kvasnice, kyselina nikotinová, kyselina thiomočová, laktát, lipovitan,
manóza, mechloretamin, merkaptopurin, methicillin, metolazon, mitomycin, niacin,
niacinamid, nikotinát hlinitý, nutramin, obezita, orotát draselný,
oxytetracyklin, paralen, pelentan, pentostatin, plegomazin, prokain penicilin
G, propranolol, propylthiouracil, proteinová dieta, purinová dieta,
pyrazinamid, rifampin, rtuťová diuretika, scutamil C, sorbit, spasmoveralgin,
sulfanilamid, superanabolon, těhotenství (poslední týdny), tensamin, teofylin,
tetracyklin, thiamin, thiazidy, thionein, thiotepa, threonin, tomanol,
triamteren, trimecryton, tuková dieta, tyramin, tyrosin, urandil, vinkristin,
warfarin, xylitol, zidovudin, aj.
Koncentraci kyseliny močové v moči
snižují: citrát, formaldehyd, hydroxymáselná kyselina, laktát, prokain
penicilin G, trimecryton, urandil, aj.
Koncentraci kyseliny močové v moči
zvyšují: acetoacetát, alanin, B-komplex, cvičení, dopamin, edecrin,
ergothionin, fenylbutazon, fruktóza, glukóza, glycin, homogentisová kyselina,
chlorpromazin, kvasnice, kyselina pyrohroznová, kvasnice, lipovitan, manóza,
proteinová dieta, spasmoveralgin, tensamin, thiamin, tomanol, xylitol, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-03-02