Stanovení vakomycinu
Synonyma
Lyphocin,
Vancocin, Vancoled
(1S, 2R, 18R, 19R, 22S, 25R, 28R, 40S)-48-{[(2S, 3R, 4S, 5S, 6R)- 3-{[(2S, 4S, 5S, 6S)-4-amino-5-hydroxy-4, 6-dimethyloxan-2-yl]oxy}-4,
5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-22-(karbamoylmethyl)-5,
15-dichlor-2, 18, 32, 35, 37-pentahydroxy-19-[(2R)-4- methyl-2-(methylamino)pentanamido]-20, 23, 26, 42,
44-pentaoxo-7, 13- dioxa- 21, 24, 27, 41, 43-pentaazaoktacyclo[26.14.2.23,6.214,17.18,12.129,33.010,25.034,39]pentakonta-3,
5, 8(48), 9, 11, 14, 16, 29(45), 30, 32, 34, 36, 38, 46,
49-pentadekaen-40-karboxylová kyselina
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo v plazmě (antikoagulans
EDTA, heparin, citronan, šťavelan). Odběr se provádí 2 h po dávce (maximum) a
před další aplikací (minimum). Vzorek krve nutno zpracovat do 4 h. Existuje
riziko adsorpce na separační gely.
Stabilita vzorku: 20 – 25 °C 2 – 24 h, 4 – 8 °C 1 – 8 dní; -20 °C
1 – 10 týdnů. Jedno zamrazení se dovoluje.
Biologický poločas vankomycinu je 4 – 8 h.
Poznámky k
analytické metodě
Imunochemické postupy jsou nejběžnější.
První imunochemický postup, který byl použit, byl kompetitivní RIA. Radioaktivní konjugát vankomycinu s 125I
soutěžil s vankomycinem ze vzorku o specifickou protilátku zakotvenou na
zkumavkách. Po separaci volné a vázané fáze byl měřený signál ve zkumavce
nepřímo úměrný koncentraci vankomycinu. Reprodukovatelnost v sérii
dosahovala CV 5,5 %.
Homogenní enzymová imunoanalýza je založena na kompetitivním principu. Vzorek je
přidán k vankomycinu označenému glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6P-DH), a pak
je přidána myší monoklonální protilátka vůči vankomycinu, dále glukóza-6-fosfát
a NAD+. Enzymová aktivita G6P-DH po navázání na protilátku klesá, a
proto může být koncentrace vankomycinu ve vzorku měřena jako aktivita G6P-DH.
G6P-DH konvertuje NAD+ na NADH, což vede ke změně absorbance, která
je měřena fotometricky při 340 nm. Endogenní G6P-DH v séru nevstupuje do
reakce, protože NAD+ je v testu účinná pouze s bakteriálním (Leuconostoc mesenteroides) enzymovým
konjugátem. Pokles absorbance měřený dvoubodovou kinetikou je přímo úměrný
koncentraci tobramycinu ve vzorku. Rozsah metody 3,35 –
33,5 µmol/l. Preciznost
měla CV rámci laboratoře 2,0 – 6,1 %.
Při FPIA soutěží fluoresceinem značený vankomycin a volný
vankomycin ze vzorku o vazebná místa specifické myší monoklonální protilátky.
Pouze konjugát vázaný na protilátku poskytuje v polarizačním světle fluorescenční
signál, takže měřená fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci vankomycinu ve
vzorku. Rozsah metody je do 69 µmol/l. Vyšší koncentrace vankomycinu nutno
ředit. Analytická citlivost 1,38 µmol/l. Preciznost v sérii CV 2,61 – 4,25
%, mezi sériemi 0,63 – 0,88 %, celkem 2,94 – 4,26 %; výtěžnost 98,9 – 105,5 %.
CEDIA využívá rekombinantní DNA
technologie, kdy donor a akceptor enzymu po spojení vytvoří aktivní
β-galaktosidázu, která reaguje s galaktopyranosidovým substrátem za
vzniku barevného produktu chlorfenolové červeně. Kozí protilátka proti myší protilátce vůči vankomycinu
zabraňuje vzniku aktivního enzymu, pokud se neváže na vankomycin ze vzorku.
Takže intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vankomycinu ve vzorku.
Rozsah metody bez ředění je do 55,2 µmol/l. Analytická citlivost byla 1,1
µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosáhla CV 2,6 – 6,7 %.
Luminiscenční imunoanalýza (LIA) s esterem akridinu jako markerem je
v kompetitivním uspořádání. Vankomycin ze vzorku soutěží
s vankomycinem označeným esterem akridinu o omezený počet vazebných míst
na monoklonální myší protilátce vůči vankomycinu navázané na kozí protilátku na
paramagnetických částicích. Po krátké inkubaci jsou paramagnetické částice
odděleny v magnetickém poli a promyty, aby se odstranila volná protilátka
s esterem akridinu. Pak jsou částice suspendovány v roztoku peroxidu
vodíku a chemiluminiscenční reakce je nastartována po nástřiku roztoku
hydroxidu sodného do suspenze, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu a emisi
luminiscence. Intenzita luminiscence detekovaná luminometrem při 400 nm je
nepřímo úměrná koncentraci vankomycinu ve vzorku. Rozsah metody je do 69
µmol/l. Vyšší koncentrace vankomycinu nutno ředit. Analytická citlivost 1,38
µmol/l. Preciznost v sérii CV 1,6 – 3,0 %, celkem 3,1 – 6,2 %; výtěžnost
98,9 – 106,6 %, odezva na linearitu 98 – 108 %.
Turbidimetrická
inhibiční imunoanalýza s využitím homogenních částic (PETINIA) používá
syntetický konjugát částice s vankomycinem a specifickou monoklonální myší
protilátku vůči vankomycinu. Vankomycin ve vzorku soutěží s konjugátem o
protilátku a tím snižuje rychlost agregace. Proto je rychlost agregace nepřímo
úměrná koncentraci tobramycinu ve vzorku. Rychlost agregace se měří pomocí
turbidimetricky měření při 340 nm. Rozsah metody do 34,5 µmol/l. Analytická
citlivost 2,4 µmol/l. Preciznost v sérii CV 1,5 – 4,2 %, celkově 1,7 – 6,0
%.
HPLC technikou na
reverzní fázi byly stanoveny sérum, likvor i peritoneální tekutina.
K rozdělení byla použita oktadecylsilanová kolona s mobilní fází: 9 %
acetonitril, 10 % octan amonný, 81 % destilovaná voda. Vzorek byl před
chromatografii extrahován do směsi acetonitril - izopropylalkohol 1:1 a
sraženina bílkovin odstředěna. Detekční limit byl 0,069 µmol/l. Rozsah metody
do 69 µmol/l. Detekce byla provedena fotometricky při 214 nm.
Reprodukovatelnost v sérii měla CV 5,80 – 6,28 %, mezi dny 11,1 – 11,4 %.
Mezinárodní referenční materiál pro vankomycin byl
připraven již v roce 1959 firmou Ely Lilly pod číslem 302-174AD-191B. 1 mg materiálu odpovídá
1007 IU.
Toleranční rozpětí v je
EKK 24 %.
Interference
Výsledky stanovení vankomycinu snižuje: bilirubin (při extrémních
koncentracích), hemolýza (2 g/l), aj.
Výsledky stanovení
vankomycinu zvyšují: lidské anti-myší protilátky (HAMA), lipémie (5 g/l), renální
dysfunkce, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-03-03