Stanovení urey (močoviny)
Synonyma
močovina,
diaminmethanal, diaminomethanon, karbamid,
karbonyldiamid, karbonyldiamin, BUN (blood urea nitrogen)
urea
Preanalytická
fáze
Stanovení se provádí
v séru, plazmě (antikoagulans heparinát lithný nebo sodný) a moči. Vzorek
krve zpracovat do 15 min po odběru. Fluoridy a citronan inhibují ureázovou
reakci. Nelze použít heparinát amonný. Separační gely stanovení neovlivňují. Po
oddělení krvinek je urea v séru nebo plazmě stabilní při 20 – 25 °C 1 den
– 1 týden, 4 – 8 °C 3 dny – 2 týdny, -20 °C 3 – 24 měsíců. Protože urea podléhá
bakteriálnímu rozkladu, měly by být před analýzou vzorky plazmy, séra i moče
skladovány při 4 – 8 °C. Hodnoty se zvyšují s věkem a při proteinové dietě
a infúzi aminokyselin.
Při stanovení v moči je
obvyklé ředění 1+20 nebo 1+50. Vzorky moče je vhodné okyselit na pH < 4
(jinde uvedeno pH < 7). Stabilita v moči při 20 –
25 °C 2 dny, 4 – 8 °C 7 – 10 dní, ‑20
°C 1 – 3 měsíce. Moč je sbíraná do plastových lahví
(polystyrén) bez konzervačních látek a po dobu sběru se doporučuje skladovat
odběrové nádoby v lednici. Před odlitím vzorku je nutno střádanou moč
řádně promíchat, změřit objem s přesností na 10 ml (u velmi malých dětí
s přesností na 1 ml); uvést přesně dobu sběru.
Poznámky
k analytické metodě
Urea se stanovuje většinou nepřímo po
převedení na amoniak enzymem ureázou, méně často přímou chemickou reakcí.
Berthelotova reakce převádí amoniak
chlornanem na chloramin, který s fenolem dává modrý indofenolový komplex,
jehož absorbance se měří při 630 nm. Reakci katalyzuje nitroprusid sodný a může
se provádět bez deproteinace nebo s deproteinací. I když je reakce
citlivá, má poměrně úzkou oblast linearity. Vzorky moče se před analýzou ředí
10 – 15-krát. Vzorky moče se musí korigovat na přítomnost amoniaku (močový
blank bez ureázy), kterého je v moči až 1000-krát více než v séru.
Glutamátdehydrogenázová metoda je nejběžnější
pro stanovení urey v séru i moči. Amoniak vzniklý ureázovou reakcí
redukuje kyselinu α-ketogulatovou na glutamovou a současně se NADH oxiduje
na NAD+. Oxidoredukční reakce je katalyzována
glutamátdehydrogenázou.
Reakce je velmi specifická a rychlá. Sleduje se pokles absorbance při
340 nm. Exogenní amoniak může způsobit falešné zvýšení výsledků. Ale
v kinetickém uspořádání se endogenní amoniak rychle spotřebuje i při
stanovení v moči, takže pozdější pokles absorbance je vyvolán jen
ureázovou reakcí s ureou. Preciznost reakce dosahuje v séru CV
v sérii 0,9 – 1,3 %, celkem 1,8 – 2,0 %; CV v moči ≤ 4,5 %.
Běžný postup je lineární do 49,2 mmol/l v séru a 4290 mmol/l v moči.
Americká asociace klinické chemie
v roce 1980 navrhla jako referenční metodu pro stanovení v séru
metodu s ureázou a glutamátdehydrogenázou po odbílkování Somogyi činidlem
(roztok hydroxidu barnatého a síranu zinečnatého) v manuálním uspořádání.
Výtěžnost byla sledována pomocí 14C urey a dosáhla 100,6 %. Metoda
je lineární do 30 mmol/l. Celková preciznost dosáhla CV 0,78 – 2,92 %, pro
koncentrace < 10 mmol/l až 4,88 %. Interference > 2 % jsou pouze při
koncentraci bilirubinu 1000 µmol/l, hemoglobinu 10 g/l a hydroxyurey 6 mmol/l.
Shoda s Berthelotovou metodou je velmi dobrá (y = 1,011x – 0,09),
s diacetylmonoximovým postupem už slabší (y = 0,968x + 0,7).
Reakce s diacetylmonoximem je jediná přímá
chemická metoda stanovení urey. Metoda není dostatečně specifická a činidlo je jedovaté
a korozívní. Dříve ale byla poměrně rozšířená. Diacetylmonoxim nejdříve
hydrolyzuje na diacetyl a hydroxylamin. Diacetyl pak kondenzuje s ureou
v kyselém prostředí na žlutý diazin, jehož absorbance se sleduje při 550
nm (nebo fluorescence při 415 nm). Zesílení zbarvení a jeho stabilizaci lze
dosáhnout buď přímo (thiosemikarbazidem, železitými ionty nebo
glukuronolaktonem) nebo nepřímo (eliminací hydroxylaminu persíranem draselným).
Stanovení v séru i v moči lze automatizovat a dosáhnout preciznost CV
2,5 – 6,5 % na horní hranici normálního rozmezí. Hlavním problémem této metody
je fotosenzitivita a rychlé blednutí zbarvení. Má-li být metoda lineární je
nutné poměrně značné ředění vzorku. Při analýze interferují další dusíkaté
sloučeniny přítomné v séru. Také látky obsahující ve své struktuře ureové
zbytky (citrulin, aloxan, alantoin) dávají barevné produkty. Jsou však obsaženy
v séru v nízké koncentraci. Kreatinin a bílkoviny neinterferují,
protože jejich chromogeny mají jiné absorpční maxima.
Reakci
o-ftalaldehydu s primárními aminy v kyselém
prostředí lze také použít ke stanovení urey. Při reakci vzniká izoindolin,
který s 8-(4-amino-1-metylamino)-6-metoxychinolinem v kyselém
prostředí dává chromofor absorbující při 510 nm. Metoda se používá málo, protože
při ní interferují primární aminy.
Konduktometrické stanovení urey je také
poměrně často používaný velmi specifický a rychlý postup v séru i v moči.
Nárůst vodivosti se sleduje v kinetickém režimu, aby se eliminoval vliv
endogenní konduktivity. Amoniak vzniklý z urey dává s oxidem
uhličitým uhličitan amonný a tím vzrůstá vodivost v reakční směsi.
Preciznost stanovení dosahuje CV 3,4 %.
Ion-selektivní
elektroda monitoruje vznik amoniaku při ureázové reakci
a je součástí vybavení některých menších analyzátorů. Ureáza je kovalentně
vázaná na pevnou fázi matrice zakotvené na elektrodě. Detekce se provádí
potenciometricky, je velmi specifická a používá se v elektrochemických
analyzátorech.
Suchá chemie využívá reakce
amoniaku (vzniklého po reakci vzorku s ureázou) barevným indikátorem pH.
Reakce probíhá na filmu nebo proužku a detekce je pomocí reflexní fotometrie.
Na rozptylové vrstvě je imobilizovaná ureáza a v alkalickém prostředí
prochází amoniak přes polopropustnou membránu a reaguje s barevným
indikátorem pH. Barvivo obsahuje merocyanin (maximum absorbance při 520 nm,
obvyklé měření při 670 nm), bromkrezolovou zeleň (sleduje se změna ze zelené na
modrou při 600 nm, s absorpčním maximem při 620 nm) nebo n-[bis(dinitrofenol)metyl]4-t-butylpyridinium
chloride (sleduje se změna z bezbarvé na modrou při 642 nm) nebo N-propyl-4-(2,6-dinitro-4-
chlorbenzyl)-chinoloniumetansulfát (sleduje se změna při 670 nm). Tyto metody mají vynikající přesnost a
jen nepatrné interference. Problémem je omezení jejich používání pouze na
analyzátory k tomu zvlášť určené. Rozsah měření v séru 0,71 – 42,83 mmol/l, v moči 23,91 – 899,39
mmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV v séru 1,5 – 3,0 %, v moči 1,8
– 3,4 %. Hemoglobin 0,5 g/l způsobí vychýlení mmol/l.
Automatizovaná
kinetická luminometrie byla vyvinuta pro měření
malého množství urey v biologických tekutinách a dialyzátu. Metoda je
založena na hydrolýze urey a ATP ureázou (z kvasnic) v přítomnosti
hydrogenuhličitanu. Tak vzniká amoniak, ADP a fosfát. Rychlost hydrolýzy je
monitorována luminometricky reakcí ATP s luciferinem, katalyzované
luciferázou a je přímo úměrná množství přítomné urey.
HPLC metody používají buď hydrofilní interakční chromatografie s gradientem
mobilní fáze 90 % - 60 % acetonitrilu ve vodě a detekce při
210 nm, nebo derivatizace
s xanthydrolem, kdy vzniká N-9H-xanthen-9-yl-urea,
která se detekuje fluorescenčním detektorem (excitace 213 nm, emise 308 nm).
Detekční limit je 50 nmol/l fluorochromu. Druhý uvedený postup byl navržen pro
stanovení v moči.
Pro měření urey
v hemodialyzátu se také používá blízká infračervená spektroskopie.
Měření se provádí přímo během dialýzy v rozsahu 4720 – 460 cm-1.
Vychýlení
je od -4,21 do +6,48 %.
V současnosti není ustavena žádná
referenční nebo definitivní metoda.
Navrhovaný referenční postup je izotopová
diluce s GC-MS a [13C, 15N2]ureou
jako vnitřním standardem ekvilibrovaným s endogenní neznačenou ureou.
Vzorky jsou pak deproteinovány etanolem. Značená i neznačená urea je převedena
na trimetylsilyl-deriváty 2‑hydroxypyrimidinu. GC-MS postup sleduje ionty
m/z 153 a 168 pro neoznačenou ureu a m/z 156 a 171 pro izotopově značené
analogy. Mez detekce metody je 0,006 mmol/l. Vzorky byly v rozsahu 1,8 –
61,2 mmol/l. Preciznost v sérii měla CV 0,67 – 0,77 %. Dosažená
kombinovaná standardní nejistota výsledků byla 0,47 – 1,72 %.
Metoda je návazná na standardní referenční
materiál SRM 912a (čistota 99,9% ± 0,1%), který je certifikován NIST (National Bureau of Standards, Washington).
Zpráva College of
American Pathologists z roku 2001 uvádí, že nejvíce používanou metodou je
enzymová metoda s ureázou a glutamátdehydrogenázou, kterou používalo více
než polovina respondentů. Reakci o-ftalaldehydem používalo 24 %, konduktometrii
18 % a < 1 % ionselektivní elektrodu pro amonné ionty. Dále zpráva uvádí
preciznost stanovení koncentrace 7,14 mmol/l CV 3,0 – 3,4 pro konduktometrickou
metodu, 3,1 – 5,1 % pro o-ftalaldehydovou metodu a 3,0 – 6,2 % pro
glutamátdehydrogenázovou metodu. Dle kritérií kvality laboratoře (CLIA-88) má
být dosahovaná přesnost ±0,71 mmol/l nebo ±9 %, podle toho, co je větší.
Intraindividuální variace je v séru přibližně 12 % (10,3 – 17 %)a moči
17,8 – 22,7 %; interindividuální variace je v séru 13,4 – 35 % a moči 20,0
– 28,1 %. Takže žádoucí preciznost odvozená z biologické variace má CV
< 6,2 %.
Toleranční limit EHK:
15 %
(sérum, plazma), 17 % (moč); CV % pro vnitřní kontrolu kvality: 5 %.
Teoretický toleranční limit: 20,8 %.
Interference
Koncentraci urey v plazmě a séru
snižují: acidóza, EDTA, fluorid, glukóza, hemodialýza, hemolýza, IGF 1,
kouření, lipémie, oxalát, růstový hormon, těhotenství (zejména do 6. měsíce),
tymol, vegetariánská dieta, zavodnění, aj.
Koncentraci urey v plazmě a séru
zvyšují: aceton, alanin, alkalóza, amikacin, amikin, amoniak, arginin,
cyklosporin, dehydratace, edecrin, elektrošok, etylenglykol, gentamycin,
haemiton, interleukin-2, iso-mack, isoket, krezol, kyselina boritá, kyselina
octová, metylurea, menopauza, netromycin, nutramin, proteinová dieta, stres,
superanabolon, vínan, viskenit, xylitol, aj.
Koncentraci urey v moči snižují:
bakteriální kontaminace, diurnální variace (pokles vylučování v noci),
formaldehyd, IgG protilátky vůči ureáze, hladovění, kyselina boritá, kyselina octová, těhotenství (zejména do 6.
měsíce), aj.
Koncentraci urey v moči zvyšují:
alanin, glycin, nedostatek spánku, proteinová dieta, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-03-03