Stanovení
alfa-fetoproteinu (AFP)
Synonyma
AFP, a-fetoprotein, alfa-1-fetoprotein,
alfa-fetoglobulin
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA,
heparin nebo citrát), výjimečně v likvoru nebo amniové tekutině. Některé
prameny stanovení v plazmě nedoporučují. Odběr při screeningu vrozených
vývojových vad 15. -19. týden, opakovaný odběr za týden pokud jsou hodnoty
vysoké. Hemolýza při stanovení ruší. Stabilita v plné krvi při 4 – 8 °C i
při 15 – 25 °C 5 d. Stabilita v séru při 4 – 8 °C 3 – 7 d, při -20 °C 3 –
12 měsíců. Je třeba vyloučit opakované rozmrazení.
Poznámky k analytické
metodě
Elektroimunodifuze s imunoprecipitací využívá migrace AFP
v elektrickém poli na agarózovém gelu, který obsahuje protilátku vůči AFP.
Vzdálenost precipitační linie od startu odpovídá AFP a její plocha pak
koncentraci AFP. Metoda není dost citlivá, občas je popsána u analýzy amniové
tekutiny.
RIA v kompetitivním uspořádání je založena na soutěži 125I-AFP
a AFP ze vzorku o vazebná místa králičí protilátky vůči AFP (inkubace trvá 18
h). Oddělení imunokomplexu od volných antigenů lze docílit přidáním druhé
protilátky s následnou precipitací nebo je už první protilátka
imobilizována na stěně zkumavek či v jamkách mikrotitračních destiček.
Metoda je použitelná v rozsahu 1,5 – 400 µg/l. Preciznost v sérii je
7 %, mezi sériemi 8 %. Protože je pomalá, tak se už dnes nepoužívá.
IRMA používá
protilátku vůči AFP vázanou na pevnou fázi, na kterou se váže AFP ze vzorku a
pak na něj druhá protilátka vůči AFP značená 125I. V soupravě jsou použity myší monoklonální
protilátky proti dvěma různým epitopům molekuly AFP. Imunoradiometrické
stanovení AFP probíhá ve dvou krocích. Nejprve se ve zkumavkách potažených
první monoklonální protilátkou inkubují vzorky nebo kalibrátory (15 min,
třepání). Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a přidá se do nich druhá
protilátka značená 125I. Po druhé inkubaci (30 min, třepání) se
odsaje obsah zkumavek a vymyje se nenavázaná značená protilátka. Vázaná
aktivita 125I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace
alfa-fetoproteinu v kalibrátorech a vzorcích je přímo úměrná změřené
radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení šesti
sérových kalibrátorů a hodnoty AFP přítomného ve vzorcích se odečtou z této
křivky. Stanovení se provádí za laboratorní teploty. Rozsah stanovení
je 0,13 – 482 µg/l. Analytická citlivost je 0,11 µg/l, funkční citlivost je
0,24 µg/l. Preciznost v sérii 3,0 – 6,9 %, mezi sériemi 6,3 -10,9 %.
Linearita ředění je 86 – 112 %, zpětný výtěžek 88 – 119 %. Heterofilní
protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými
v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.
Neizotopové značení používá jako marker enzym, fluorofor nebo luminofor.
Tyto postupy se používají nejvíce.
ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se
zakotvenou monoklonální myší protilátkou vůči AFP. Do jamky se přidá standard
nebo vzorek a inkubuje se 5 min, pak se přidá monoklonální protilátka vůči AFP
s navázanou křenovou peroxidázou.
Po inkubaci (1 h) a promytí 4x se přidá chromogen tetrametylbenzidin a
reakce probíhající 30 min je zastavena stop činidlem (2 M H2SO4).
Měření se provádí při 450±10 nm. Celý postup se realizuje za laboratorní
teploty. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Neruší
vysoké koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani heterofilní protilátky.
Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 0 (?) – 350 µg/l (vyšší
koncentrace, zejména amniová tekutina se ředí 51x). Detekční limit je 1 µg/l.
Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 16000 µg/l. Preciznost v sérii
je 2,8 – 4,9 %, mezi sériemi 3,6 – 4,7 %. Linearita ředění 97 – 104 %, zpětný
výtěžek 97 – 104 %. Při reakci interferuje vysoký RF, antinukleární protilátky
a podávané myší monoklonální protilátky.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE
(time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál
se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Inkubace trvá 9 min. Měřený signál je po
sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek
k AFP) přímo úměrný hladině AFP. Na základě jednobodové kalibrace je
rozsah měření 0,23 – 700 µg/l (po automatickém ředění až do 500000 µg/l).
Analytická citlivost je 0,23 µg/l, funkční citlivost 1,2 µg/l. Efekt nadbytku
antigenu se neprojevuje do 500000 µg/l. Preciznost v sérii 1,0 – 1,9 %,
mezi sériemi 3,0 – 4,5 %. Hemoglobin neruší do 5 g/l, bilirubin do 273,6
µmol/l; lipémie při stanovení vadí. Linearita ředění je 90 – 110 %.
DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená
fluorescence Eu3+ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu3+
do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Komerčně dostupná je souprava
umožňující současně stanovovat AFP i free β-hCG. Mikrotitrační destičky
jsou potaženy směsí protilátek proti AFP a free β-hCG. Po pipetování
vzorku se přidají protilátky vůči AFP značené Eu3+ a free β-hCG značené Sm3+. Po
inkubaci (1 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí, pak se přidá
zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu3+
emise 613 nm, Sm3+ emise 643 nm) je přímo úměrná koncentraci analytů
ve vzorku a měří se do 1 h. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody 1
– 500 µg/l AFP, 1 – 200 µg/l free β-hCG. Analytická senzitivita je pro AFP
0,1 µg/l, pro free β-hCG 0,2 µg/l. Preciznost v sérii AFP 2,9 – 5,7
%; free β-hCG 2,0 – 14,6 %. Preciznost mezi sériemi AFP 3,0 – 4,8 %; free
β-hCG 1,9 – 19,3 %.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální
protilátkou vůči AFP a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a
nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se druhá myší monoklonální
protilátka vůči AFP značená ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát
4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož
vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1 –
350 µg/l. Vzorky s koncentrací AFP > 350
µg/l se ředí automaticky 3x (do 1050 µg/l) nebo 101x (do 35350 µg/l), popřípadě
manuálně (koncentrace po ředění musí být > 15 µg/l). Preciznost
v sérii je 2,7 – 4,6 %, celková preciznost metody je 5,2 – 9,7 % zpětný
výtěžek 94,5 – 112,7 %, linearita ředění 89,4 – 102 %. Senzitivita je 0,4 µg/l
(2 SD nulového blanku). Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 2 057600
µg/l. Při koncentraci 64000 µg/l nebyl zaznamenán detekovatelný
přenos.Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat
s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit
interference s in vitro imunologickým stanovením. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Chemiluminiscenční analýza - stanovení je založeno na nekompetitivní
(sendvičové) imunochemické reakci s detekcí záblesku vzniklého
chemiluminiscenční reakcí. AFP se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem
sérových bílkovin váže jedním epitopem na purifikovanou polyklonální králičí
protilátku značenou esterem akridinu. Následně se přidává monoklonální myší
protilátka, která je kovalentně vázaná na paramagnetické částice niklu. Reakce
probíhá 7,5 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odsátím a
promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční
záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci
AFP ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky,
která je pro přístroj specifická a je určena na základě sedmibodové základní
kalibrace při použití nových šarží činidel a dvoubodové rekalibrace po dvou
nejpozději však čtyřech týdnech. Linearita metody je do 1000 µg/l. Vzorky
s koncentrací AFP vyšší než 1000 µg/l se ředí univerzálním diluentem.
Používané manuální nebo automatické ředění je 1:10, 1:20, 1:100 a 1:200.
Naměřený výsledek obsluha nebo přístroj násobí 10x, 20x, 100x nebo 200x.
Konečná koncentrace AFP ve zředěném roztoku musí být ≥ 15,1 µg/l.
Detekční limit metody je 1,3 µg/l. Preciznost v sérii (3,4 µg/l): 2,7 –
4,0 %, mezi sériemi (3,4 µg/l): 2,0 – 4,4 %. Zpětný výtěžek: 91,9 – 109,2 %, linearita ředění: 78,1 –
117,4 %. Efekt nadbytku antigenu se do 1 000000 µg/l neprojevuje. Při
metodě neruší: hemoglobin do koncentrace 5 g/l, triacylglyceroly do koncentrace
11,4 mmol/l. Bilirubin do koncentrace 342 µmol/l
je negativní interference 5 %. Potenciální interference u metotrexátu
dosahovala +6 %.
Jiná chemiluminiscenční imunoanalýza
v sendvičovém uspořádání používá myší monoklonální protilátku vůči AFP,
zakotvenou na paramagnetických částicích ke které se přidává ředěný standard
nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální
protilátka vůči AFP značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým
pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného.
Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci AFP a sleduje se
fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje
měřit vzorky v rozmezí koncentrací 0,4 – 350 µg/l (vyšší koncentrace se
ředí manuálně nebo automaticky 16,7x, resp. 166,7). Preciznost v sérii 1,9
– 3,9 %, celkově 2,3 – 4,8 %. Zpětný výtěžek je 100,9 - 104 %. Analytická
senzitivita (2 SD nulového blanku) je 0,4 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se
neprojevuje do 1 900000 µg/l. Při koncentraci 91080 µg/l nebyl zaznamenán
detekovatelný přenos. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší. Heterofilní
protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými
v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.
CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické
částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže během první inkubace
(10 min) AFP a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace
(10 min) druhá monoklonální protilátka značená izoluminolem. Po promytí se
přidá startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem se
měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině AFP. Rozsah měření je
na základě dvoubodové kalibrace 0,4 – 1210 µg/l (při vyšších hodnotách lze
sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,4 µg/l. Preciznost v sérii 1,4 – 4,9 %, mezi sériemi 2,9
– 6,7 %. Linearita ředění je 90 – 105 %, zpětný výtěžek 98 – 100 %. Efekt
nadbytku antigenu nebyl pozorován do 859400 µg/l. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Jiné
stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci, kde je ALP jako
marker. AFP se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže
jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové
kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop AFP s polyklonální králičí
protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37
°C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá
substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou
fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku
záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná
koncentraci AFP ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle
kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě
dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového
kódu činidla. Linearita metody je do 361 µg/l. Vzorky s koncentrací AFP
vyšší než 361 µg/l se ředí univerzálním diluentem. Doporučené ředění je 1 díl
vzorku + 9 dílů ředícího roztoku (lze provádět automaticky na analyzátoru nebo
manuálně) a naměřený výsledek přístroj nebo obsluha (v manuálním postupu)
násobí 10x. Vzorky s extrémně vysokými koncentracemi AFP lze ředit 100x nebo
dokonce 1000x univerzálním diluentem. Detekční limit metody: 0,24 µg/l (2 SD),
citlivost: 0,24 µg/l (CV ≤ 20 %). Preciznost v sérii (3,4 µg/l):
< 3,7 %, mezi sériemi (3,4 µg/l): < 7,2 %. Zpětný výtěžek: 96 - 108 %. Efekt nadbytku antigenu se do 643
000 µg/l neprojevuje. Hemoglobin do koncentrace 1,92 g/l neinterferuje. Bilirubin do koncentrace
342 µmol/l vykazuje negativní
interferenci 5 %.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se
pipetuje myší monoklonální protilátka vůči AFP značená ALP a standard nebo
vzorek. Pak se přidají paramagnetické částice potažené myší monoklonální
protilátkou vůči AFP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím
odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Rozsah
měření při 470 nm na základě sedmibodové kalibrace je 0,5 – 3000 µg/l (po ředění
17x až 51000 µg/l, nebo manuálně 101x až 303000 µg/l). Analytická citlivost
(nulový kalibrátor) 0,5 µg/l. Linearita ředění je 101 – 110 %, zpětný výtěžek
101 – 107 %. Preciznost v sérii 2,7 – 3,2 %, celková 3,4 – 4,4 %. Efekt
nadbytku antigenu nebyl prokázán do 500000 µg/l. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v
lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými
v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
Jako marker lze
použít také křenovou peroxidázu a luminiscenčním substrátem je pak luminol. Při sendvičovém stanovení v mikrotitračních
destičkách jsou použity myší monoklonální protilátky vůči dvěma různým epitopům
AFP. Vzorky a kalibrátory se nejprve inkubují v jamkách potažených první
monoklonální protilátkou (1 h, 37 °C, třepání). Po inkubaci se obsah jamek
promyje 4x a přidá se do nich konjugát druhé protilátky s křenovou peroxidázou.
Po druhé inkubaci (1 h, 37 °C, třepání) se opět jamky 4x promyjí, aby se
odstranil nenavázaný konjugát. Přidá se signální činidlo (luminol) a započne
peroxidázou katalyzovaná luminiscenční reakce. Emitovaný světelný signál se
měří luminometrem mezi 5. a 15. minutou. Koncentrace AFP ve vzorcích je přímo
úměrná změřenému světelnému signálu a získá se interpolací z pětibodové
kalibrační křivky. Rozsah stanovení je 0,6 – 482 µg/l. Analytická citlivost je 0,6 µg/l,
funkční citlivost < 1,2 µg/l. Preciznost v sérii 4,3 %, mezi sériemi
8,1 %. Linearita ředění je 77 – 122 %, zpětný výtěžek 94,6 – 126 %. Koncentrace
triacylglycerolů do 11,3 mmol/l stanovení neruší.
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza
v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI
zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální
biotinylované protilátky vůči AFP. První reagencie (Chemibeads) je potažena
monoklonální protilátkou vůči AFP a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá
reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační
barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii
Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální
protilátka-AFP-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie
Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma
částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii
Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads
a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612
nm a je přímo úměrný koncentraci AFP ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C.
Rozsah metody je 0,5 – 1000 µg/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah
měření 20x). Detekční limit je 0,5 µg/l. Preciznost v sérii 0,1 – 12,7 %, mezi
sériemi 0,2 – 17,9 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1 000000 µg/l.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou
(ECLIA)v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován
s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči AFP a monoklonální
myší protilátkou vůči AFP značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové
formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a
celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy.
Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí
magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí
tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny
na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na
základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla.
Luminiscence je přímo úměrná koncentraci AFP ve vzorku. Chylozita, hemolýza,
ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami
biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od
posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,6 – 1210 µg/l
(ředění 50x automaticky, ale koncentrace po ředění musí být > 24 µg/l.
Detekční limit je 0,61 µg/l. Preciznost v sérii CV 1,4 – 2,4 %, mezi sériemi
2,5 – 3,8 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1 210000 µg/l. Pokud se
použije plazma s citronanem sodným, musí být výsledky korigovány o +10 %.
Standard imunochemických metod je obvykle vztažen na WHO preparát č.
72/225, pak 1 µg/l = 0,83 kIU/l. Při stanovení mohou interferovat
HAMA (lidské anti-myší protilátky).
Toleranční limit EHK: 20 %.
Interference
Snížené hodnoty: zpracování neředěného vzorku,
triacylglyceroly > 11 mmol/l, alkoholici s jaterní poruchou, těhotné
s nízkou hmotností plodu, chybný týden gestace, transplantace ledvin a
jiné.
Zvýšené hodnoty: chronický alkoholismus, těhotenství od 10.
týdne, dvojčata, kuřačky, chybný týden
gestace, hemodialýza a jiné.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28