Stanovení beta-2-mikroglobulinu

Stanovení beta-2-mikroglobulinu

 

Synonyma

Thymotaxin, B2M, B2m, Ly-m11

 

Preanalytická fáze

β₂-Mikroglobulin se stanovuje přednostně v séru. Lze jej stanovit také v plazmě (antikoagulancia EDTA, heparin) nebo v moči. Stabilita β₂-mikroglobulinu je při 18 - 26 °C: v séru i plazmě 1 d, při 2 - 8 °C: v séru 3 d, v plazmě 7 d, při -20 °C: v séru i plazmě 12 týdnů (až 6 měsíců). Stabilita při -70 °C je neomezená.

Stabilita β₂-mikroglobulinu v moči je při 2 - 8 °C: 1 d, při -20 °C: 3 měsíce. Pro nesbíranou moč není vhodný první ranní vzorek, který má obvykle nižší pH než 6,0. Vzorek moče z mikce přeneseme do 10 ml zkumavky obsahující 60 µl 2 M NaOH (důvodem je udržení pH moče v rozmezí 6 - 7).

Stanovení lze provést také v likvoru. Stabilita β₂-mikroglobulinu je při 2 - 8 °C 7 d, při -20 °C 2 týdny. 

 

Poznámky k analytické metodě

IRMA sendvičového typu používá k ukotvení na polystyrenové zkumavce polyklonální protilátku vůči β₂-mikroglobulinu. Po přidání standardu nebo vzorku a inkubaci (třepání 30 min) následuje dvojnásobné promývání. Pak se přidá monoklonální protilátka vůči β₂-mikroglobulinu značenou ¹²⁵I a opět se inkubuje (třepání 30 min). Přebytek druhé protilátky je odstraněn dekantací a měřený signál gama-záření je přímo úměrný koncentraci β₂-mikroglobulinu. Kalibrace je osmibodová.

ELISA se může u lidského β₂-mikroglobulinu provádět v supernatantu buněčných kultur, séru, plazmě, moči, likvoru, slinách a mléku. Protilátka vůči β₂-mikroglobulinu je zakotvena v jamkách mikrotitračních destiček (je chráněná před vazbou s druhou protilátkou). Přidá se standard nebo vzorek a po inkubaci (obvykle 2 h) a promytí (obvykle 5x fosfátovým pufrem) pak druhá protilátka vůči β₂-mikroglobulinu s biotinylovou kotvou. Po inkubaci (obvykle 1h) a promytí (obvykle 5x fosfátovým pufrem) následuje připojení křenové peroxidázy přes streptavidinový můstek. Detekce se provádí při 450 nm (nebo bichromaticky 450/570 nm) po reakci s dimetylbenzidinem, která je zastavena po 10 min stop činidlem (0,5 M HCl nebo 0,3 M H₂SO₄). Modrá barva roztoku se po okyselení mění na žlutou (stabilita asi 10 min). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Kalibrace je šestibodová. Detekční limit je 0,049 mg/l, zpětný výtěžek 85 – 111 %, interval měření 1 – 12 mg/l. Linearita při ředění je 85 – 104 %, preciznost v sérii 4,9 %, mezi sériemi 7,2 %.

Jiná varianta ELISA v sendvičovém uspořádání umožňuje kratší reakční dobu. Do mikrotitrační destičky se zakotvenou protilátkou vůči β₂-mikroglobulinu se přidá standard nebo vzorek a poté křenová peroxidáza se streptavidinovým můstkem a druhá protilátka vůči β₂-mikroglobulinu s biotinylovou kotvou. Po inkubaci 1 h a promytí 6x se přidá chromogen dimetylbenzidin a reakce je zastavena po 15 min stop činidlem. Bichromatické měření 450/620 nm nutno provést do 30 min. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Detekční limit je 0,2 mg/l, zpětný výtěžek 98 – 105 %, interval měření 0,4 – 12 mg/l. Preciznost v sérii 5,3 – 8,1 %, mezi sériemi 4,8 – 9,2 % pro sérum, resp. v sérii 4,4 – 7,4 %, mezi sériemi 4,9 – 9,2 % pro moč.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje zředěný vzorek a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči β₂-mikroglobulinu a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se druhá myší monoklonální protilátka proti β₂-mikroglobulinu značená ALP a po inkubaci a promytí substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0 – 4 mg/l. Vzorky lze ředit automaticky 20x a interval měření rozšířit do 80 mg/l. Celková preciznost metody je 5,57 – 8,74 % zpětný výtěžek 95 – 102,1 %. Senzitivita je 1,02 µg/l.

Chemiluminiscenční analýza je jednostupňová imunoreakce sendvičového typu, kdy se přidává k polystyrenové kuličce s kotvící kozí protilátkou vůči β₂-mikroglobulinu stanovovaná bílkovina a následně roztok myší protilátky vůči β₂-mikroglobulinu značené ALP (z telecího střeva) v pufru. Po 30 minutové inkubaci při 37 °C se nenavázaná druhá protilátka odstraní promytím při centrifugaci. Přidá se substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s ALP za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za produkce záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci celkového beta-2-mikroglobulinu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Interval měření je 4 – 500 µg/l, analytická citlivost 4 µg/l. Automatické ředění pro sérum 40x posunuje interval měření na 80 – 2000 µg/l, ale přesto bude občas zapotřebí další manuální ředění vzorku. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10000 µg/l. Přítomnost bilirubinu do 340 µmol/l stanovení neruší. Preciznost metody v sérii 3,4 – 7,9 %, mezi sériemi 7,0 – 10,1 %. Zpětný výtěžek při stanovení v moči 91 – 114 %, linearita ředění séra 89 – 102 %, moče 89 – 104 %.

Aglutinační princip používá králičí polyklonální protilátku vůči β₂-mikroglobulinu vázanou na latexové částice. Vzniklý zákal se měří turbidimetricky při 700 nm. Kalibrace je dvoubodová. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 60 mg/l. Zpětný výtěžek při koncentraci 2,2 mg/l byl ±10 %. Neprojevoval se vliv bilirubinu do 1026 µmol/l, hemoglobinu do 10 g/l a revmatoidního faktoru do 200 kIU/l. Gamapatie (především IgM) může způsobit nespolehlivé výsledky. Rozsah měření 0,1 – 8 mg/l (při vyšších koncentracích lze automaticky ředit 11x). Mez detekce metody je 0,1 mg/l. Preciznost metody v sérii 0,8 – 1,4 %, mezi sériemi 1,2 – 1,5 %.

Jiný aglutinační princip používá protilátku vůči β₂-mikroglobulinu vázanou na polyetylentereftalát (PET). Kalibrace je šestibodová. Inkubace imunoreakce 2 min. Detekční limit metody je 0,26 mg/l. Interval pro měření je 0,5 – 17 mg/l.  Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 110 mg/l. Celková preciznost metody je 3,9 – 6,5 %. Zpětný výtěžek 90 – 110 %. Analýzu neruší hemoglobin do 10 g/l, bilirubin do 10 mmol/l, triacylglyceroly do 14,1 mmol/l.

Je značná nestabilita β₂-mikroglobulinu v moči, zejména při pH 5,5. Destrukci proteinu lze zabránit alkalizací moče pomocí hydrogenuhličitanu.

Koncentrace β₂-mikroglobulinu jsou při věku nad 30 let mírně vyšší u žen oproti mužům.

Toleranční limit EHK: 21 %.

 

Interference

Hladiny β₂-mikroglobulinu v séru jsou závislé na funkci ledvin. Při poškození glomerulů dochází ke snížené filtraci β₂-mikroglobulinu, jeho koncentrace v séru se zvyšují. Zvýšená koncentrace je popsána i při transplantacích srdce nebo jater. Rovněž vyšší hladiny jsou při podání α-TNF. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Snížení koncentrace β₂-mikroglobulinu v séru je při hemodialýze.

Při poruše tubulárního systému není naopak β₂-mikroglobulinu účinně reabsorbován a zvyšuje se jeho koncentrace v moči. Při expozici kadmiu, tělesném cvičení a horečnatých stavech je také β₂-mikroglobulin v moči vyšší.

Koncentrace β₂-mikroglobulinu se snižuje v moči při pH < 6. Při leukocyturii s vysokým pH moče dochází k destrukci β₂-mikroglobulinu proteolytickými enzymy. Vadí také opakované rozmrazení moče. Snížení hodnoty v moči jsou při expozici rtuťovým parám.

Při hodnocení hladin β₂-mikroglobulinu je vždy třeba vyloučit onemocnění ledvin.

 

Další informace

Principy analytických postupů

 

 

Petr Štern, 2014-01-28