Stanovení CA 15-3
Synonyma
nádorový marker CA 15-3, CA 15-3 protein, CA15-3
protein, Cancer Antigen 15-3 protein, Breast Tumor protein, Carbohydrate
Antigen CA 15-3, Carbohydrate antigen 15.3,
ANTIGEN CA 015 003, Antigen CA 15 3, Antigen
CA 15.3, Antigen CA 15-3, Antigen CA-15-3, CA 15 3 Antigen, CA 15.3 Antigen, CA
15.3 Carbohydrate antigen 15.3, CA 15-3 Antigen, CA, Ca15-3, Cancer Ag 15-3,
Cancer Antigen 15-3, DF3 Antigen, Episialin, Antigen Epithelial Membrane,
Epithelial membrane antigen, Epithelial Mucin Polymorphic, MUC1, Glycosylated MUC-1, ImMucin, MUC MUCIN 001, MUC-1
antigen, Muc1 Mucin, Mucin Muc1, Mucin Peptide, Mucin Peptide MUC-1,
Polymorphic Epithelial Mucin.
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát
lithný nebo EDTA). Ruší hemolýza a chylozita. Opakované zamrazení se
nedoporučuje. Stabilita vzorku: 8 h při 20 – 25 °C, 1 – 14 d při 4 – 8 °C, 3 –
12 měsíců při -20 °C.
Poznámky k analytické
metodě
IRMA je dvoukrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do
zkumavek potažených streptavidinem a pak následuje přidání monoklonální
protilátky 115D8 a inkubace 1 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a
zkumavky se 3x promyjí. Pak se přidá druhá monoklonální protilátka DF3 značená 125I.
Po inkubaci (1 h, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min).
Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah metody na základě
šestibodové kalibrace je 1,35 – 300 kU/l; analytická citlivost 0,24 kU/l,
funkční citlivost 1,35 kU/l. Preciznost v sérii je 1,33 – 1,84 %, mezi
sériemi 3,12 – 4,66 %; zpětný výtěžek 104 – 108 %, linearita ředění 83,9 – 92,1
%.
Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 7500 kU/l.
Jiná IRMA používá zkumavky potažené monoklonální protilátkou 115D8. Pak
je postup jednokrokový (přidává se ředěný vzorek a MAb 125I-DF3)
s inkubací 2 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a zkumavky se
3x promyjí. Navázaná aktivita se změří
gama-počítačem (1 min). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah
metody na základě šestibodové kalibrace je 2 – 300 kU/l; analytická citlivost 2
kU/l. Preciznost v sérii je 2,8 – 2,9 %, mezi sériemi 4,2 – 4,9 %; zpětný
výtěžek 97 – 104 %, linearita ředění 94 – 101 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do
12300 kU/l.
ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou myší monoklonální
protilátkou vůči CA 15-3 (některé testy
používají destičku potaženou streptavidinem a biotinylovaná Ab se zakotví až
během testu). Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (30 min) se
roztok odsaje a jamky 5x promyjí. Pak se přidá druhá (králičí) protilátka proti
CA 15-3 označená křenovou peroxidázou (některé
testy používají myší monoklonální protilátku s POD, také lze pipetovat
vzorek a druhou protilátku za sebou a sendvič vytvořit v jediné delší
inkubaci). Imunoreakce se provádí se 30 min, roztok se odsaje a jamky 5x
promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 20 min ve tmě) a následně
stop činidlo (1 M HCl, případně 1 M H2SO4). Měření se
provádí při 450 nm do 15 min na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 1
– 200 kU/l (některé testy do 240 kU/l).
Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Preciznost v sérii 3,8 –
5,5 %, mezi sériemi 5,2 – 7,9 %. Zpětný výtěžek 85,8 – 114,1 %, linearita
ředění 95,2 – 113,8 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Analytická citlivost
je 0,905 kU/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 3000 kU/l.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené
myší monoklonální protilátkou vůči 115D8. Po inkubaci se reakční směs přenese
na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se myší monoklonální
protilátka vůči DF3 značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se
dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující
umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je
v rozsahu 0,3 – 250 kU/l. (Vzorky s hodnotami CA 15-3 > 250 kU/l lze
automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí
10x – hodnota po ředění musí být > 15 kU/l a po vynásobení do 2500 kU/l).
Preciznost v sérii je 2,8 – 6,1 %, celková preciznost metody je 3,8 – 8,6
%; zpětný výtěžek 93 – 108 %. Analytická senzitivita je 0,3 kU/l. Ani vysoké
koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší, přestože
v preanalytické části se nedoporučují.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE
(time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál
se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 14 min mezi CA 15-3 ze
vzorku, monoklonální protilátkou vůči CA 15-3 značenou Eu3+ a
monoklonální protilátkou vůči CA 15-3, která je připojena na sběrný protein.
Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených
monoklonálních protilátek k CA 15-3) přímo úměrný hladině CA 15-3. Na
základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,3 – 500 kU/l (po automatickém
ředění až do 40000 kU/l). Analytická citlivost je 0,3 kU/l, funkční citlivost
1,0 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 40000 kU/l. Preciznost
v sérii 0,4 – 2,2 %, mezi sériemi 2,1 – 7,0 %. Hemoglobin neruší do 5 g/l,
triacylglyceroly do 9 mmol/l, bilirubin nevadí. Linearita ředění je 90 – 110 %.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči 115D8 zakotvenou na
paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po
inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči
DF3 značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32
% peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence
je přímo úměrná hladině CA 15-3 a sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové
kalibrace v rozmezí hodnot 1 – 800 kU/l (Vzorky s hodnotami CA 15-3 >
800 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém
vzorek naředí 5x, po ředění musí být hodnota > 30 kU/l). Preciznost
v sérii je 1,7 – 4,7 %, celkově 2,2 – 5,1 %; zpětný výtěžek 84 – 97 %,
linearita ředění 80 – 101 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru)
≤ 0,5 kU /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 22000 kU/l.
CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické
částice potažené myší monoklonální protilátkou 115D8 se naváže během první
inkubace (10 min) CA 15-3 a po promytí se na jeho další epitop připojí během
další inkubace (10 min) druhá monoklonální protilátka DF3 značená izoluminolem.
Po promytí se přidá startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a
fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině CA 15-3.
Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,5 – 1000 kU/l (při vyšších
hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,5
kU/l. Preciznost v sérii 1,8 – 3,1
%, mezi sériemi 3,6 – 7,6 %. Linearita ředění je 101 – 107 %, zpětný výtěžek 96
– 109 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 30720 kU/l. Ani vysoké
koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Podobný princip zábleskové
luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku
pacientského séra se přidá monoklonální myší protilátka vůči 115D8 značená
fluoresceinem ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu a
monoklonální myší protilátka vůči fluoresceinu, která je vázaná kovalentně na paramagnetické
částice ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Inkubuje se 4,66
min při 37°C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá monoklonální myší protilátka vůči DF3 značená esterem
akridinu a inkubuje se 21,66 min při 37 °C. Po
odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned
se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě
šestibodové kalibrace. Vzorky s hladinou CA 15,3 > 200 kU/l se ředí 5x, 10x nebo
20x automaticky nebo manuálně. Vzorky > 4000 kU/l CA 15-3 se ředí pouze
manuálně. Analytická citlivost je 0,5 kU/l. Preciznost
v sérii 4,4 – 5,1 %, mezi sériemi 3,6 – 5,4 %. Linearita ředění je 92,3 –
108,8 %, zpětný výtěžek 89,5 – 101,6 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo
ikterus, ačkoliv v preanalytické části se nedoporučuje zpracovávat takové
vzorky.
Jiné stanovení je založeno
na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem.
CA 15-3 se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na
myší monoklonální protilátku vůči CA 15-3 imobilizovanou na polystyrénové
kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo CA 15-3 naváže druhá
monoklonální protilátka vůči CA 15-3 konjugovaná s alkalickou fosfatázou.
Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu
odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který
hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu.
Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita
záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci CA 15-3 ve vyšetřovaném vzorku.
Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická
a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky
získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 300 kU/l, avšak do
hodnoty 80000 kU/l nebyl pozorován efekt nadbytku protilátky. Analytická
citlivost je 1 kU/l. Preciznost v sérii 5,5 – 8,1 %, celková 7,4 – 8,8 %;
zpětný výtěžek 89 – 114 %, linearita ředění 95 – 105 %.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se
pipetuje standard nebo vzorek obsahující CA 15-3, paramagnetické částice potažené
kozí protilátkou proti biotinu, monoklonální myší protilátka vůči CA 15-3
s biotinovou kotvou a druhá monoklonální myší protilátka vůči CA 15-3
značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní
nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo
je přímo úměrné množství CA 15-3. Rozsah měření při 470 nm na základě
šestibodové kalibrace je 0,5 – 1000 kU/l. (po ředění 10x až do 10000 kU/l).
Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 30000 kU/l. Preciznost v sérii
je 1,4 – 2,2 %, mezi sériemi 1,6 – 4,1 %. Linearita ředění je 84,9 – 115,9 %.
Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Senzitivita stanovení je 80,3 %, specificita 98,7 %.
Chemiluminiscenční
analýza v sendvičovém provedení, kdy CA 15-3 ze vzorku se váže na
biotinylovanou myší monoklonální protilátku vůči 115D8. Imunokomplex se naváže
na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci se promytím odstraní volný
materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči DF3 značená křenovou
peroxidázou. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se
luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD
za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů
(substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho
emisi.
Signál na základě dvoubodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci CA 15-3 ve
vzorku. Rozsah měření 0,7 – 500 kU/l (vyšší koncentrace CA 15-3 jsou
automaticky ředěné 5x). Analytická senzitivita 0,3 kU/l, funkční senzitivita
0,7 kU/l. Preciznost v sérii 1,2 – 2,7 %, mezi sériemi je 1,8 – 6,6 %.
Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 47000
kU/l.
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza
v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI
zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální
biotinylované protilátky vůči M11. První reagencie (Chemibeads) je potažena
monoklonální protilátkou vůči 115D8 a obsahuje chemiluminiscenční barvivo.
Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje
fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou
protilátkou DF3 a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy:
částice–monoklonální protilátka–CA 15-3–biotinylovaná protilátka. Poté jsou
přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové
imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky
680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do
reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je
měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný koncentraci CA 15-3 ve vzorku.
Analýza trvá 16 min při 37 °C. Rozsah metody na základě pětibodové kalibrace je
1 – 300 kU/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 10x, lze také
ředit manuálně). Detekční limit je 1 kU/l. Preciznost v sérii 1,4 – 2,9 %, mezi
sériemi 2,4 – 4,0 %. Zpětný výtěžek 96,3 – 105,1 %, linearita ředění 92 – 102 %.
Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 kU/l.
Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší (navzdory doporučení).
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován
s monoklonální myší protilátkou vůči DF3 značenou ruthéniovým komplexem a
biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči 115D8. Pak se přidají
paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže
imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící
komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CA 125 ve vzorku.
Metoda je použitelná v rozsahu 1 – 300 kU/l. Ředění při vyšších koncentracích
10x, je-li hodnota po ředění > 30 kU/l. Analytická citlivost (2 SD nulového
kalibrátoru) je 1 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 1 kU/l. Preciznost
v sérii < 3,4 %, mezi sériemi < 4,3 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF
(< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5
mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu.
Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 kU/l.
Toleranční limit EHK: 18 %.
Interference
Snížené hodnoty: efekt nadbytku antigenu.
Zvýšené hodnoty: někdy v těhotenství (8 % žen) a při laktaci (4 – 7
% žen), při hemodialýze, transplantaci ledvin.
Heterofilní protilátky působí nespecificky.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28