Stanovení CA 19-9
Synonyma
nádorový antigen CA 19-9; Cancer Antigen 19-9, Carbohydrate Antigen
19-9;
Cancer associated CA 19-9; gastrointestinal tumor antigen; CA 19-9
protein, CA 19-9 native protein.
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru. Stanovit lze pouze u Lewis pozitivních
(95 – 97 % populace). Stanovení v plazmě je rozporuplné (některé prameny
varují před antikoagulanty). Ruší hemolýza a chylozita. Je třeba zabránit
kontaminaci slinami. Doporučuje se včasná separace séra (do 2 h). Opakované
zamrazení se nedoporučuje. Stabilita vzorku: 7 d při 20 – 25 °C, 7 – 30 d, při
4 – 8 °C, 3 – 12 měsíců při -20 °C.
Poznámky k analytické
metodě
IRMA je dvoukrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do
zkumavek potažených monoklonální protilátkou vůči CA 19-9, pak následuje
inkubace 2 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a zkumavky se 2x
promyjí. Pak se přidá druhá monoklonální protilátka vůči CA 19-9 značená 125I.
Po inkubaci (1 h, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min).
Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah metody na základě
šestibodové kalibrace je 2 – 480 kU/l; analytická citlivost 2 kU/l. Preciznost
v sérii je ≤ 7,9 %, mezi sériemi ≤ 7,0 %; zpětný výtěžek 86 – 111 %, linearita ředění
88 – 113 %.
Jiná IRMA používá zkumavky potažené streptavidinem a v prvním kroku
se přidává protilátka 1116NS19-9 s biotinovou kotvou, na kterou se váže CA
19-9 ze vzorku. Následuje inkubace 1 h (třepání). Po inkubaci se supernatant
odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Pak se přidává protilátka 1116NS19-9 značená
125I a opět se inkubuje 1 h (třepání). Po inkubaci se supernatant
odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná
aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Celý postup se provádí za laboratorní
teploty. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 0,1 – 240 kU/l
(vzorky > 240 kU/l se ředí 10x); analytická citlivost 0,1 kU/l. Preciznost
v sérii je 2,0 – 8,5 %, mezi sériemi 5,4 – 15,6 %; zpětný výtěžek 86,7 –
101,1 %, linearita ředění průměrně 108 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do
1500000 kU/l.
ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou monoklonální
protilátkou vůči CA 19-9. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (90
min, třepání, 37 °C) se roztok odsaje a jamky 4x promyjí. Pak se přidá druhá
monoklonální protilátka proti CA 19-9 označená křenovou peroxidázou.
Imunoreakce se provádí se 90 min (třepání, 37 °C), roztok se odsaje a jamky 4x
promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 20 min ve tmě za
laboratorní teploty) a následně stop činidlo. Měření se provádí při 450 nm do
15 min na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 10 – 600 kU/l (některé testy 0,2 – 240 kU/l).
Preciznost v sérii 8,4 – 9,6 %, mezi sériemi 1,9 – 8,7 %. Zpětný výtěžek 85,5
– 98,5 %, linearita ředění 93,1 –
114,7 %. Hemolýza, lipémie a ikterus
neruší. Analytická citlivost je 0,2
kU/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 3840 kU/l.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené
myší monoklonální protilátkou vůči 1116-NS-19-9. Po inkubaci se reakční směs
přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se myší
monoklonální protilátka vůči 1116-NS-19-9 značená ALP v pufru TRIS. Po
inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí
na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky.
Šestibodová kalibrace je v rozsahu 2 – 500 kU/l. (Vzorky s hodnotami CA
19-9 > 500 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění
systém vzorek naředí 10x – hodnota po ředění musí být > 30 kU/l a po
vynásobení do 5000 kU/l). Preciznost v sérii je 3,7 – 11,4 %, celková
preciznost metody je 6,2 – 19,1 %; zpětný výtěžek 96 – 105 %. Analytická
senzitivita je 2 kU/l.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE
(time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál
se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 14 min mezi CA 19-9 ze
vzorku, monoklonální protilátkou vůči CA 19-9 značenou Eu3+ a
monoklonální protilátkou vůči CA 19-9, která je připojena na sběrný protein.
Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených
monoklonálních protilátek k CA 19-9) přímo úměrný hladině CA 19-9. Na
základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 1,2 – 700 kU/l (po automatickém
ředění až do 600000 kU/l). Analytická citlivost je 1,2 kU/l, funkční citlivost
7,2 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 600000 kU/l. Preciznost
v sérii 1,4 – 3,0 %, mezi sériemi 4,8 – 5,9 %. Hemoglobin neruší do 5 g/l,
triacylglyceroly do 9 mmol/l, bilirubin nevadí. Linearita ředění je 95 – 115 %.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči 1116-NS-19-9 zakotvenou na
paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po
inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči
1116-NS-19-9 značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se
přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá
chemiluminiscence je přímo úměrná hladině CA 19-9 a sleduje se fotonásobičem při
429 nm. Metoda dovoluje měřit vzorky na základě
šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 2 – 1200 kU/l (Vzorky s hodnotami
CA 19-9 > 1200 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém
ředění systém vzorek naředí 10x, po ředění musí být hodnota > 30 kU/l).
Preciznost v sérii je 2,3 – 8,0 %, celkově 3,4 – 8,5 %; zpětný výtěžek 89
– 108 %, linearita ředění 92 – 117 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového
kalibrátoru) ≤ 2 kU /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1750000
kU/l. Zavlečená chyba se do hodnoty 320000 kU/l neprojevila.
Podobný princip zábleskové
luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku
pacientského séra se přidá monoklonální myší protilátka vůči CA 19-9,
která je vázaná kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru
hovězího sérového albuminu. Inkubuje se 21 min při 37°C. Po odsátí roztoku
a promytí zkumavek se přidá monoklonální
myší protilátka vůči CA 19-9 značená esterem akridinu a inkubuje se 21,66 min
při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá
peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk
fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky
s hladinou CA 19-9 > 700 kU/l se ředí 10x, 100x nebo 200x automaticky
nebo manuálně. Analytická citlivost je 1,2 kU/l. Preciznost v sérii 3,5 – 10,4 %, mezi sériemi 2,4 – 5,3 %.
Linearita ředění je 80 – 127 %, zpětný výtěžek 87,7 – 103,2 %. Analýzu neruší
hemolýza, chylozita nebo ikterus, ačkoliv v preanalytické části se
nedoporučuje zpracovávat takové vzorky. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován
do 5800000 kU/l. Hemolýza, chylozita a ikterus dle výrobce neruší.
CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické
částice potažené myší monoklonální protilátkou 1116NS se naváže během první
inkubace (10 min) CA 19-9 a po promytí se na jeho další epitop připojí během
další inkubace (10 min) druhá monoklonální protilátka 1116NS značená
izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H2O2 +
4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná
hladině CA 19-9. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,3 – 1000
kU/l (při vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická
citlivost je 0,3 kU/l. Preciznost
v sérii 1,9 – 10,0 %, mezi sériemi 4,9 – 7,5 %. Linearita ředění je 102 –
107 %, zpětný výtěžek 97 – 107 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do
1550000 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů
neruší.
Jiné stanovení je založeno
na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem.
CA 19-9 se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na
myší monoklonální protilátku vůči CA 19-9 imobilizovanou na polystyrénové
kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo CA 19-9 naváže druhá
myší monoklonální protilátka vůči CA 19-9 konjugovaná s alkalickou fosfatázou.
Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu
odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který
hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu.
Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita
záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci CA 19-9 ve vyšetřovaném vzorku.
Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a
vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do
1000 kU/l, avšak do hodnoty 50000 kU/l nebyl pozorován efekt nadbytku
protilátky. Analytická citlivost je 1 kU/l. Preciznost v sérii 4,2 – 7,5
%, mezi sériemi 5,5 – 6,9 %; zpětný výtěžek 96 – 108 %, linearita ředění 69 –
104 %. Hemolýza, chylozita a ikterus dle výrobce neruší.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se
pipetuje standard nebo vzorek obsahující CA 19-9, paramagnetické částice
potažené kozí protilátkou proti biotinu, monoklonální myší protilátka vůči CA
19-9 s biotinovou kotvou a druhá monoklonální myší protilátka vůči CA 19-9
značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní
nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo
je přímo úměrné množství CA 15-3. Rozsah měření při 470 nm na základě
šestibodové kalibrace je 0,8 – 2000 kU/l. (po ředění 10x až do 20000 kU/l).
Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 800000 kU/l. Preciznost
v sérii je 1,7 – 6,4 %, mezi sériemi 2,4 – 5,7 %. Linearita ředění je 88,6
– 108,3 %.
Chemiluminiscenční
analýza v sendvičovém provedení, kdy CA 19-9 ze vzorku se váže na
biotinylovanou myší monoklonální protilátku vůči 1116-NS-19-9. Imunokomplex se
naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci se promytím odstraní volný
materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči 1116-NS-19-9 značená
křenovou peroxidázou. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá
se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje
POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů
(substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho
emisi.
Signál na základě dvoubodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci CA 19-9 ve
vzorku. Rozsah měření 1,4 – 1000 kU/l (vyšší koncentrace CA 19-9 jsou
automaticky ředěné 20x). Analytická senzitivita 1,05 kU/l, funkční senzitivita
1,4 kU/l. Preciznost v sérii 0,9 – 1,4 %, mezi sériemi je 2,6 – 5,3 %.
Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 965000
kU/l. Při stanovení interferuje hemolýza (vyšší výsledky).
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza
v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji
dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované
protilátky vůči CA 19-9. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální
protilátkou vůči CA 19-9 a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie
(Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo.
Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou CA 19-9 a reagencii
Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy: částice–monoklonální protilátka–CA
19-9–biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou
se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením
komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni
singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční
reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný
koncentraci CA 19-9 ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody na
základě pětibodové kalibrace je 2 – 1000 kU/l (automatické ředění umožňuje
zvětšit rozsah měření 20x nebo 100x; lze také ředit manuálně). Detekční limit
je 1 kU/l. Preciznost v sérii 1,0 – 5,8 %, mezi sériemi 2,4 – 13,8 %. Zpětný
výtěžek 91,8 – 115,5 %, linearita ředění 97,1 – 103,1 %. Efekt nadbytku
antigenu nebyl pozorován do 1000000 kU/l. Hemolýza,
chylozita ani ikterus dle výrobce neruší.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován
s monoklonální myší protilátkou vůči CA 19-9 značenou ruthéniovým
komplexem a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči CA 19-9. Pak se
přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže
imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící
komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CA 19-9 ve
vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,6 – 1000 kU/l. Ředění při vyšších
koncentracích 10x, je-li hodnota po ředění > 50 kU/l. Analytická citlivost
(2 SD nulového kalibrátoru) je 0,6 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %)
0,6 kU/l. Preciznost v sérii < 4,5 %, mezi sériemi < 4,9 %. Hemolýza,
chylozita a ikterus neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. >
5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu.
Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 500000 kU/l.
Toleranční limit EHK: 20 %.
Interference
Snížené hodnoty: efekt nadbytku antigenu, opakované rozmrazení séra,
Lewis-a a Lewis-b negativní.
Zvýšené hodnoty: sliny, mléko, sputum, bronchiální sekret, seminální
tekutina, cervikální mukus, žaludeční šťáva, amniová tekutina, tekutina
ovariálních cyst, moč, mekonium, stolice, cholestáza, menstruace, těhotenství
(zvýšení do 70 – 120 kU/l), transplantace jater.
Heterofilní protilátky působí nespecificky.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28