Stanovení CA 125
Synonyma
CA-125; nádorový antigen CA 125, nádorový marker CA 125, carbohydrate
antigen 125; cancer antigen 125, ovarian
cancer antigen, ovarian cancer-related tumor marker CA125, ovarian carcinoma
antigen CA125; MUC16, MUC-16,
mucin-16.
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát
lithný). Ruší hemolýza, ikterus i chylozita. Transport krve do laboratoře
v den odběru. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Stabilita vzorku 5 d
při 4 – 8 °C, 3 měsíce při -20 °C.
Poznámky k analytické
metodě
IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním
ředěného séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči CA 125
a přidáním druhé protilátky vůči Ca 125 značené 125I. Po inkubaci (4
h, laboratorní teplota, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x
promyjí. Navázaná aktivita se změří
gama-počítačem (1 min). Rozsah metody je 1 – 400 kU/l, analytická citlivost 1
kU/l. Preciznost v sérii je < 3,4 %, mezi sériemi < 11,1 %; zpětný
výtěžek 89 – 105 %, linearita ředění 102 – 124 %. Vysoké koncentrace bilirubinu (> 100
µmol/l) a hemoglobinu (> 0,5 g/l) mohou stanovení ovlivnit. Efekt nadbytku
antigenu nebyl pozorován do 20000 kU/l.
ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou myší monoklonální
protilátkou vůči CA 125 (některé testy
používají destičku potaženou streptavidinem a Ab se zakotví až během testu).
Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a ihned druhá (králičí) protilátka proti CA
125 označená křenovou peroxidázou (některé
testy používají myší monoklonální protilátku s POD, nebo se vazba POD na
protilátku uskuteční až během testu přes streptavidin-biotinový můstek). Po
inkubaci (90 min, 37 °C) se odsaje roztok, jamky se 5x promyjí. Pak se přidá
tetrametylbenzidin (inkubace 20 min ve tmě, laboratorní teplota) a následně
stop činidlo (1 M HCl). Měření se provádí při 450 nm do 15 min na základě
šestibodové kalibrace v rozmezí 5 – 400 kU/l (některé testy do 600 kU/l). Silná hemolýza, zákal a lipémie ruší.
Analytická citlivost je 5 kU/l.
Na trhu je také ELISA s velkou citlivostí (0,1 kU/l), ale malým
rozsahem měření (do 32 kU/l).
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené
ovčí protilátkou vůči CA 125. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a
nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se myší monoklonální protilátka
vůči OC125 značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje
substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon,
jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu
2 – 600 kU/l. (Vzorky s hodnotami CA 125 > 600 kU/l lze automaticky nebo
manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x – hodnota po
ředění musí být > 15 kU/l). Preciznost v sérii je 3,1 – 24,3 %, celková
preciznost metody je 5,0 – 27,3 %, linearita ředění 92 – 109 %. Analytická
senzitivita je 2 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší, přestože v preanalytické části se nedoporučují.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE
(time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál
se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 29 min mezi CA 125 ze
vzorku, monoklonální protilátkou vůči CA 125 značenou Eu3+ a
monoklonální protilátkou vůči CA 125, která je připojena na sběrný protein.
Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených
monoklonálních protilátek k CA 125) přímo úměrný hladině CA 125. Rozsah
měření je 1 – 600 kU/l (po automatickém ředění až do 100000 kU/l). Kalibrace je pouze jednobodová. Analytická
citlivost je 1 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 7,8 kU/l. Preciznost v sérii 0,9 – 3,4 %, mezi
sériemi 4,8 – 6,8 %. Linearita ředění je 92 – 108 %. Neruší hemoglobin < 5 g/l,
triacylglyceroly < 9 mmol/l, bilirubin < 274 µmol/l. Efekt nadbytku
antigenu nebyl pozorován do 100000 kU/l.
DELFIA je v poslední době nahrazena fluorescenční metodou zvanou
AlphaLISA. V tomto případě se do mikrotitrační destičky pipetuje
vzorek, pak se přidá akceptorová kulička potažena protilátkou vůči CA 125 a
druhá volná protilátka vůči CA 125 s biotinylovou kotvou. Proběhne inkubace
60 min při 23 °C. Přidá se donorová kulička potažena streptavidinem a proběhne
druhá inkubace 30 min při 23 °C ve tmě. Takto vznikne komplex, kde donorová
kulička po ozáření 680 nm uvolní singletový kyslík, který vyvolá fluorescenci
akceptorové kuličky 615 nm. Rozsah měření je 1,5 – 3000 kU/l, analytická
citlivost 1,5 kU/l. Preciznost v sérii 3,1 – 15 %, mezi sériemi 5,1 – 19,5
%. Zpětný výtěžek 67 (3 kU/l) – 89 %, linearita ředění 94 – 105 %. Tento postup
lze provádět i v buněčných kulturách.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči OC 125 zakotvenou na
paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po
inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči
M11 značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32
% peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence
je přímo úměrná hladině CA 125 a sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové
kalibrace v rozmezí hodnot 1 – 1000 kU/l (Vzorky s hodnotami CA 125 >
1000 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém
vzorek naředí 10x, po ředění musí být hodnota > 20 kU/l). Preciznost
v sérii je 1,5 – 3,2 %, celkově 1,7 – 4,3 %; zpětný výtěžek 82 – 96 %,
linearita ředění 96,3 – 110,6 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového
kalibrátoru) ≤ 1 kU /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 180000
kU/l.
Podobný princip zábleskové
luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku
pacientského séra se přidá monoklonální myší protilátka vůči M11 značená
esterem akridinu a monoklonální myší protilátka vůči OC125 značená
fluoresceinem ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci
18 min při 37 °C se přidá monoklonální myší protilátka vůči fluoresceinu, která
je vázaná kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru
hovězího sérového albuminu. Reakce probíhá 18 min při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá
peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk
fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky
s hladinou CA 125 > 600 kU/l se ředí 10x nebo 20x automaticky nebo
manuálně. Analytická citlivost je 2 kU/l. Preciznost
v sérii 3,7 – 4,3 %, mezi sériemi 1,2 – 2,5 %. Linearita ředění je 88,1 –
112,5 %, zpětný výtěžek 84,9 – 104,4 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo
ikterus, ačkoliv v preanalytické části se nedoporučuje zpracovávat takové
vzorky. Efekt
nadbytku antigenu se při měření může projevit.
CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické
částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči CA 125 se naváže během
první inkubace (10 min) CA 125 a po promytí se na jeho další epitop připojí
během další inkubace (10 min) druhá monoklonální protilátka vůči CA 125 značená
izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H2O2 + 4
% NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině
CA 125. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,3 – 1000 kU/l (při
vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost
je 0,3 kU/l. Preciznost v sérii 1,4
– 2,7 %, mezi sériemi 3,6 – 6,8 %. Linearita ředění je 94 – 101 %, zpětný
výtěžek 93 – 96 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 106700 kU/l. Ani
vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Jiné stanovení je založeno
na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem.
CA 125 se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na
myší monoklonální protilátku vůči CA 125 imobilizovanou na polystyrénové
kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo CA 125 naváže
polyklonální králičí protilátka vůči CA 125 konjugovaná s alkalickou
fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem.
Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci CA 125 ve
vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je
pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v
kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah
kalibrace je do 500 kU/l, avšak do hodnoty 80000 kU/l nebyl pozorován efekt
nadbytku protilátky. Analytická citlivost je 1 kU/l. Preciznost v sérii
3,9 – 5,1 %, celková 4,6 - 11 %; zpětný výtěžek 84 – 101 %, linearita ředění 94
– 123 %. Neinterferují bilirubin (< 342 µmol/l), hemoglobin (< 1,92 g/l),
triacylglyceroly (< 33,9 mmol/l).
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se
pipetuje standard nebo vzorek obsahující CA 125, paramagnetické částice
potažené monoklonální myší protilátkou vůči CA 125 a druhá monoklonální myší
protilátkou vůči CA 125 značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli
a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční
substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství CA 125. Rozsah měření při
470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,5 – 5000 kU/l. (po ředění 20x až
do 100000 kU/l). Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 120000 kU/l.
Preciznost v sérii je 1,3 – 2,4 %, mezi sériemi 3,3 – 6,0 %. Linearita
ředění je 100,4 – 114,3 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší. Senzitivita stanovení je 95,8 %, specificita 98,9 %.
Chemiluminiscenční
analýza v sendvičovém provedení, kdy CA 125 ze vzorku se váže na biotinylovanou
myší monoklonální protilátku vůči epitopu M11. Imunokomplex se naváže na jamky
potažené streptavidinem. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a
přidá se myší monoklonální protilátka vůči epitopu OC 125 značená křenovou
peroxidázou. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se
luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD
za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů
(substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě
dvoubodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci CA125 ve vzorku. Rozsah měření
5,5 – 1000 kU/l (vyšší koncentrace CA 125 jsou automaticky ředěné 20x).
Analytická senzitivita 2,9 kU/l, funkční senzitivita 5,5 kU/l. Preciznost
v sérii 0,9 – 2,4 %, mezi sériemi je 2,2 – 5,3 %. Hladiny biotinu
zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Efekt
nadbytku antigenu nebyl pozorován do 340000 kU/l. Zákal ve vzorcích ruší
stanovení.
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza
v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI
zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální
biotinylované protilátky vůči M11. První reagencie (Chemibeads) je potažena
monoklonální protilátkou vůči OC 125 a obsahuje chemiluminiscenční barvivo.
Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje
fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou
protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy
částice-monoklonální protilátka-CA 125-biotinylovaná protilátka. Poté jsou
přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové
imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky
680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do
reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je
měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný koncentraci CA 125 ve vzorku.
Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je 1,5 – 1000 kU/l (automatické
ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 10x). Detekční limit je 1,5 kU/l. Preciznost
v sérii 0,3 – 17 %, mezi sériemi 0,2 – 12,2 %. Zpětný výtěžek 83,8 – 108,7
%, linearita ředění 89,2 – 108,7 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do
110000 kU/l. Hemolýza, chylozita ani
ikterus neruší (navzdory doporučení).
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován
s monoklonální myší protilátkou vůči OC 125 značenou ruthéniovým komplexem
a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči M11. Pak se přidají
paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže
imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící
komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CA 125 ve vzorku.
Metoda je použitelná v rozsahu 0,6 – 5000 kU/l. Ředění při vyšších
koncentracích 10x, je-li hodnota po ředění > 200 kU/l. Analytická citlivost
(2 SD nulového kalibrátoru) je 0,6 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %)
0,6 kU/l. Preciznost v sérii < 3,4 %, mezi sériemi < 4,3 %. Hemolýza,
chylozita, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými
dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od
posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000
kU/l.
Toleranční limit EHK: 17 %.
Interference
Snížené hodnoty: efekt nadbytku antigenu.
Zvýšené hodnoty: v první polovině menstruačního cyklu,
v těhotenství (zejména v 3. trimestru).
Heterofilní protilátky působí nespecificky.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28