Stanovení estradiolu

Stanovení estradiolu

 

Synonyma

17β-estradiol, β-estradiol, cis-estradiol, E2, oestradiol; dihydrofolliculin, dihydrofolikulin;
Estrace, Progynon, Aerodiol, Aquadiol, Diogynets  a desítky dalších lékových forem;

1,3,5-estratriene-3,17β-diol; 3,17β-dihydroxy-1,3,5(10)-estratriene, 17β-estra-1,3,5(10)-triene-3,17-diol.
Poznámka: v češtině bude pochopitelně v systematických názvech estratrien nebo trien.

Preanalytická fáze

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin), moči (také 24 h sběr), likvoru nebo slinách. Stabilita analytu v séru 1 d při 20 – 24 °C, 1 – 14 d při 2 – 8 °C, 1 měsíc až 5 let při -20 °C. Plná krev je stálá při 15 – 25 °C i 4 °C alespoň 168 h. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Odběr do evakuovaných zkumavek hodnoty snižuje.

U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu. Je vhodné uvést den cyklu.

 

Poznámky k analytické metodě

RIA je kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány 3 h (při indukované ovulaci 1 h) za stálého třepání při laboratorní teplotě s ¹²⁵I-E2 ve zkumavkách potažených specifickou protilátkou. Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci estradiolu ve vzorku. Rozsah měření na základě sedmibodové kalibrace 22 – 18350 pmol/l. Analytická citlivost je 22 pmol/l. Preciznost v sérii je ≤ 12,1 %, mezi sériemi ≤ 11,2 %; linearita ředění 83 -108 %, zpětný výtěžek 82 -111 %. Křížová reakce estron 2,31 %. Souprava není vhodná pro stanovení estradiolu u dětí.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, který používá zakotvenou králičí protilátku vůči IgG a do jamek se přidává vzorek nebo kalibrátor, estradiol značený POD a protilátka proti E2 (monoklonální protilátka vůči E2 může také být zakotvená přímo v jamkách). Po inkubaci (2 h, některé soupravy jen 1 h) a promytí 4x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂ v acetáto-citrátovém pufru. Roztok se inkubuje 30 min ve tmě, pak se pipetuje stop činidlo (3,6 M H₂SO₄). Absorbance při 450 nm se měří do 1 h a je nepřímo úměrná koncentraci estradiolu ve vzorku.  Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 18,3 – 3431 pmol/l (některé soupravy až do 11744 pmol/l). Preciznost v sérii je 3,9 – 4,6 %, mezi sériemi 6,0 – 6,1 %; linearita ředění 87 – 101 %, zpětný výtěžek 78,4 – 106 %. Křížová reaktivita estron 1,9 %, ostatní ≤ 0,6 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené protilátkami proti estradiolu. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím, zatímco imunokomplex se váže na skleněnou matrici. Přidá se konjugát estrogenu s ALP, který obsadí zbylé volné místa protilátky. Po inkubaci a promytí (oddělení nenavázaného konjugátu) se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 20 – 3670 pmol/l. Vzorky s hodnotami estradiolu 917 – 18350 pmol/l se ředí automaticky, ještě vyšší koncentrace lze ředit manuálně 10x. Preciznost v sérii je 3,1 – 11,0 %, celková preciznost metody je 4,8 – 15,2 %. Analytická senzitivita je 20 pmol/l, funkční senzitivita 28 pmol/l. Erytrocyty mohou při metodě interferovat (zvýšené výsledky).

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá 2 h za laboratorní teploty mezi estradiolem ze vzorku a estradiolem, který je připojený na sběrný protein o vazebná místa na monoklonální protilátce vůči E2 značené Eu³⁺. Měřený signál je nepřímo úměrný koncentraci estradiolu. Na základě sedmibodové kalibrace (ředěním jediného kalibrátoru!) je rozsah měření 70 – 73400 pmol/l . Křížová reaktivita estradiol 3-glukuronid 58,1 %, estradiol 3-sulfát 12,3 %, ostatní < 0,7 %.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena kozí protilátka vůči králičímu IgG. V sekvenčním uspořádání se pipetuje estradiol ze vzorku a specifická králičí protilátka (inkubace 30 min, třepání, laboratorní teplota). Poté se přidá estradiol značený Eu³⁺ (inkubace 2 h, třepání, laboratorní teplota). Při koncentracích > 500 pmol/l se pipetují všechny složky najednou a v kompetitivním uspořádání je reakční doba jen 1 h. Po promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je nepřímo úměrná koncentraci estradiolu ve vzorku a měří se do 1 h. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody do 15000 pmol/l (při vyšších koncentracích nutno ředit).

Chemiluminiscenční analýza v dvoukrokovém uspořádání používá monoklonální králičí protilátku vůči E2 zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá konjugát estradiolu značený akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině estradiolu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 36,7 – 3670 pmol/l (Vzorky s hodnotami E2 > 3670 pmol/l lze automaticky 5x nebo manuálně ředit 10x; po ředění musí být hodnota > 367 pmol/l). Preciznost v sérii je 1,4 – 6,4 %, celkově 1,8 – 7,4 %. Funkční senzitivita 51 pmol/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita estron 0,7 %.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Králičí protilátka vůči 17β-estradiolu-6 se inkubuje spolu se vzorkem 18,7 min, pak se přidají paramagnetické latexové částice potažené myší protilátkou vůči králičímu IgG a estradiol značený esterem akridinu. Opět se inkubuje 18,7 min. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Vzorky s koncentrací estradiolu > 3670 pmol/l se ředí 2x, 5x nebo 10x. Analytická citlivost je 44 pmol/l, funkční citlivost 67,9 pmol/l. Preciznost v sérii 4,1 – 5,1 %, mezi sériemi 5,2 – 7,0 %. Linearita ředění je 93,8 – 106,9 %, zpětný výtěžek 89,2 – 113,0 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Křížová reakce: 17β-estradiol 3-benzoát 41,3 %, 4-hydroxyestradiol 2,08 %, ostatní < 1,1 %.

CLIA je dvoustupňový kompetitivní zábleskový postup. Magnetické částice jsou potažené protilátkou vůči estradiolu a estradiol ze vzorku se na ni váže během první inkubace (21 min). Pak se přidá konjugát estradiolu s izoluminolem. Imunoreakce probíhá 4 min; po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině estradiolu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 44 – 4037 pmol/l (vyšší koncentrace lze ředit 5x). Analytická citlivost 44 pmol/l. Preciznost v sérii 7,6 – 9,4 %, mezi sériemi 5,5 – 14,7 %; zpětný výtěžek 66 – 146 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší.

Jiné stanovení je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Estradiol v prostředí pufrovaného roztoku soutěží s estradiolem značeným ALP o vazebná místa na polyklonální králičí protilátce imobilizované na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 60 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná koncentraci estradiolu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah měření je 73 - 7342 pmol/l. Vzorky s koncentrací estradiolu vyšší než 4404 pmol/l je vhodné ředit. Analytická citlivost 55 pmol/l. Preciznost v sérii 4,3 – 9,9 % %, celková 6,7 % – 16 %; linearita ředění 93 – 110 %, zpětný výtěžek 91 – 104 %. Hemolýza, bilirubin a lipémie neruší. Křížová reaktivita d-Equilenin 3,3 %, ethinylestradiol 2,6 %, ostatní < 0,9 %. Vysoké hladiny estriolu (novorozenci) mohou interferovat.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující estradiol, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči králičímu E2. Po inkubaci (20 min) se přidá konjugát estradiolu s ALP a během inkubace se obsadí zbylá vazebná místa protilátky. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství estradiolu. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 73 – 17621 pmol/l. (po ředění 2x až do 35242 pmol/l). Analytická citlivost 73 pmol/l. Linearita ředění je 104 – 123 %, zpětný výtěžek 88 – 120 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita estron 1,98 %. Zákal ruší stanovení.

Chemiluminiscenční analýza v kompetitivním provedení, kdy estradiol ze vzorku soutěží s estradiolem značeným křenovou peroxidázou o omezený počet vazebných míst biotinylované protilátky (směs králičí a ovčí protilátky). Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Promytím se odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci estradiolu ve vzorku. Rozsah měření 23,3 – 14000 pmol/l (vyšší koncentrace E2 jsou automaticky ředěné 5x). Analytická senzitivita 8,0 nmol/l, funkční senzitivita 23,3 nmol/l. Preciznost v sérii 1,0 – 6,6 %, mezi sériemi je 2,3 – 9,5 %. Bilirubin 342 µmol/l interferuje +19,4 %, hemoglobin 5g/l interferuje -12,8 %. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Křížová reaktivita na estron 2,95 %, estriol 0,52 %.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v kompetitivním uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči E2. První reagencie (Chemibeads) je potažena estriolem a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads. Estradiol ze vzorku soutěží s estriolem na Chemibeads o omezené množství vazebných míst na biotinylované protilátce. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je nepřímo úměrný koncentraci estradiolu ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 40 – 5506 pmol/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 5x). Analytická citlivost je 40 pmol/l, funkční citlivost 69 pmol/l. Preciznost v sérii 1,1 – 11,1 %, mezi sériemi 1,9 – 15,6 %. Zpětný výtěžek 99,7 – 110,3 %. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší. Při stanovení interferuje celá řada látek: kofein, vysoký cholesterol, dextran 40, kyselina salicylová, vysoký albumin výsledky snižují; ibuprofen, vysoká celková bílkovina, vysoký IgG výsledky zvyšují.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (35 µl) je inkubován s biotinylovanou polyklonální králičí protilátkou vůči estradiolu. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a konjugát estradiolu s ruthéniovým komplexem, který obsadí zbylá volná místa na protilátce.  Imunokomplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci estradiolu ve vzorku. Hemoglobin, chylozita, ikterus a RF (< 1200 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 18,4 – 15781 pmol/l. Vyšší koncentrace se ředí 5x (rozsah do 78905 pmol/l). Analytická citlivost 18,4 pmol/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 44 pmol/l. Preciznost v sérii CV 1,3 – 4,6 %, mezi sériemi 1,9 – 9,9 %. Interference léků jsou < 0,9 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu.

Referenční metoda ID-GC/MS byla vypracována v roce 1996. Izotopové ředění probíhá s estradiolem-d₃ v acetátovém pufru. Po extrakci éterem se éterový podíl odpaří a zbytek se rozpustí ve směsi metanol- izopropylalkohol 1:1. Roztok se aplikuje na kolonu a za sníženého tlaku se vymývá metanolem. Metanol se odpaří, přidá se acetonitril a kyselina heptafluoromáselná. Po tepelné úpravě se přidá fosfátový pufr a hexan. Po extrakci se odebere horní hexanová vrstva, odpaří se a odparek se rozpustí v izooktanu a nastříkne na chromatograf. Kapilární kolona se postupně vyhřívá od 80 na 240 °C. Na hmotovém spektrometru se v ionizačním modu sledují píky m/z 664,4 a 667,4. Detekční limit je 55 pmol/l. Funkční citlivost 110 pmol/l. Kalibrace dovoluje stanovení do 1468 pmol/l (po ředění i dvojnásobek). Preciznost v sérii < 6,1 %.

Certifikovaný referenční materiál nese označení CRM576, CRM 577, a CRM 578.

Toleranční limit EHK: 22 %.

 

Interference

Snížené hodnoty: cvičení, hladovění, alkoholismus, vrozené enzymopatie nadledvinek, hyperprolaktinémie, menopauza, selhávání hypofýzy, hypotyreóza, sacharidová dieta, nízkotučná dieta (až o 17 %), bioflavonoid chrysin, extrakt z pepře, efavirem a jiné.

Zvýšené hodnoty: obezita, kouření (zvláště u mužů), cirhóza jater, hypertyreóza, nádory produkující estrogeny, mužská sterilita, těhotenství, termální trauma a jiné. Léky: anabolika, androgeny, diazepam, digoxin, estrogeny, klomifen, tamoxifen a jiné.

V moči zvyšují hodnoty spironolaktony: aldakton nebo verospiron.

Všechny imunoanalýzy mají nespecifickou odezvu na přítomnost heterofilních protilátek.

 

Další informace

Principy analytických postupů

 

 

Petr Štern, 2014-01-28