Stanovení folitropinu
(FSH)
Synonyma
folikulin, folikuly stimulující hormon; Follicle stimulating hormone
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans heparin) nebo
moči (obvykle odpad za 24 h). Stabilita analytu v séru 1 d při 20 – 25 °C,
1 – 7 d při 4 – 8 °C, 1 – 60 měsíců při -20 °C. V moči 3 měsíce při -20
°C. Celá krev stálá alespoň 168 h. Při odběru do EDTA nebo do citronanu jsou
hodnoty falešně nižší.
U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu.
Je vhodné uvést den cyklu.
Poznámky k analytické
metodě
K dispozici jsou stanovení, která umožňují simultánně vyšetřit FSH
a LH (s markery 57Co-LH + 125I-FSH nebo Eu3+-LH
+ Tb3+-FSH).
Koncentrace FSH v séru se může změnit během 20 min až trojnásobně,
proto se zejména v pediatrii dává přednost sběru moče za 3 h (výkyvy se
vyrovnají) a 80násobnému zahuštění vzorku.
RIA v sekvenčním uspořádání, kdy v prvním kroku reaguje FSH ze
vzorku se specifickou protilátkou a v následné inkubaci se pak přidá FSH značené
125I, není již v komerční soupravě na trhu. I když se oba
inkubační kroky podařilo výrazně zkrátit (30 + 60 min), je specifita reakce
vzhledem k podobnosti gonadotropinů neuspokojivá.
IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním
ředěného séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči FSH a
přidáním druhé protilátky vůči FSH značené 125I. Po inkubaci (90
min, laboratorní teplota, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x
promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem
(1 min). Rozsah metody je 0,2 – 180 U/l; analytická citlivost 0,2 U/l, funkční
citlivost 0,5 U/l. Preciznost v sérii je ≤ 2,6 %,
mezi sériemi ≤ 6,3 %.
ELISA používá dvou protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou a
druhá má biotinylovou kotvu. Mikrotitrační jamky jsou potaženy streptavidinem (v některých soupravách je monoklonální
protilátka zakotvena přímo v jamkách). Po inkubaci 1 h a trojnásobném
propláchnutí (protilátky se mohou
přidávat i ve dvou krocích oddělených inkubací) se přidá substrát
tetrametylbenzidin a inkubuje se 15 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (0,15
M H2SO4) a měří se při 450 nm (obvykle do 30 min). Celý postup se realizuje za laboratorní
teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,6 – 100 U/l (některé soupravy do 200 U/l). Preciznost
v sérii je 8,5 – 9,4 %, mezi sériemi 9,4 – 11,8 %. Zpětný výtěžek 91,7 – 106,7 %, linearita ředění 95,8 – 116 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do
5000 (někde dokonce do 50000) U/l.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené
myší monoklonální protilátkou vůči β-FSH. Po inkubaci se reakční směs
přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí
polyklonální protilátka vůči α-FSH značená ALP v pufru TRIS. Po
inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí
na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky.
Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,37 – 150 U/l. (Vzorky s hodnotami FSH
> 150 U/l lze manuálně ředit 2x – hodnota po ředění musí být > 0,37 U/l).
Preciznost v sérii je 3,6 – 7,7 %, celková preciznost metody je 5,1 – 10,2
%. Analytická senzitivita je 0,37 U/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu,
bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita TSH 1,2 %, ostatní
≤ 0,2 %.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE
(time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál
se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Měřený signál je přímo úměrný hladině FSH.
Souprava už není na trhu.
DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená
fluorescence Eu3+ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu3+
do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách
je zakotvena protilátka vůči FSH. V sendvičovém uspořádání se pipetuje FSH
ze vzorku a specifická protilátka značená Eu3+. Po inkubaci a
promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty.
Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci FSH ve
vzorku a měří se do 1 h. Mez detekce metody je 0,05 U/l. Rozsah metody 0,2 –
250 U/l. Preciznost v sérii 5,9 – 8,6, mezi sériemi 9,2 – 16,0 %.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči β-FSH zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které
se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem
se přidá myší monoklonální protilátka vůči α-FSH
značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 %
peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je
přímo úměrná hladině FSH a sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové
kalibrace v rozmezí hodnot 0,05 – 150 U/l (Vzorky s hodnotami FSH > 150
U/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek
naředí 5x, po ředění musí být hodnota > 0,25 U/l). Preciznost v sérii
je 2,6 – 4,2 %, celkově 3,2 – 4,6 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového
kalibrátoru) ≤ 0,05 U /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu
a triacylglycerolů neruší.
Podobný princip zábleskové
luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku
pacientského séra se přidá polyklonální ovčí protilátka vůči FSH značená
esterem akridinu. Po inkubaci 5 min při 37 °C se přidá a monoklonální myší protilátka
vůči FSH kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru hovězího
sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C následuje odsátí roztoku a
promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří
vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě
šestibodové kalibrace v rozmezí 0,3 – 200 U/l. Vzorky
s hladinou FSH > 200 U/l se ředí 2x automaticky nebo manuálně jsou-li
hodnoty > 400 U/l. Analytická citlivost je 0,3 U/l. Preciznost v sérii 2,0 – 2,9 %, mezi sériemi 0,3
– 2,7 %. Linearita ředění je 85 – 102 %, zpětný výtěžek 90,5 – 116,9 %. Analýzu
neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Efekt nadbytku antigenu se při měření může
projevit kolem 1000 U/l.
CLIA je další jednostupňový sendvičový zábleskový
postup, kdy na magnetické částice potažené protilátkou se naváže FSH a současně
se na jeho další epitop připojí druhá protilátka značená izoluminolem.
Imunoreakce probíhá 10 minut, po promytí se přidá startér (0,12 % H2O2
+ 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná
hladině FSH. Rozsah měření je na základě dvou kalibrátorů 0,25 – 400 U/l.
Analytická citlivost je 0,25 U/l, funkční citlivost 0,75 U/l. Preciznost
v sérii 2,3 – 3,8 %, mezi sériemi 2,9 – 4,8 %. Linearita ředění je 97 – 107
%, zpětný výtěžek 92 – 104 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 55000
U/l. V přítomnosti extrémně vysokých koncentrací hCG (přibližně 200 000
U/l) lze jsou hodnoty FSH přibližně o 35 % falešně nižší. Analýzu neruší
hemolýza, chylozita nebo ikterus.
Jiné stanovení je založeno
na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem.
FSH se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší
monoklonální protilátku vůči FSH imobilizovanou na polystyrénové kuličce a
současně se na druhé vazebné místo FSH naváže monoklonální myší protilátka vůči
FSH konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po
odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát
adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou
za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se
detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině
FSH ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky,
která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v
kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah
kalibrace je do 170 U/l, avšak do hodnoty 50000 U/l nebyl pozorován efekt
nadbytku antigenu. Analytická citlivost je 0,1 U/l. Preciznost v sérii 2,9
– 4,2 %, celková 4,1 – 7,9 %; zpětný výtěžek 101 – 138 %, linearita ředění 95 –
110 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly. Léčba
neplodnosti pomocí FSH způsobuje tvorbu protilátek, které interferují při
stanovení.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se
pipetuje standard nebo vzorek obsahující FSH a paramagnetické částice potažené
kozí protilátkou vůči myšímu IgG s navázanou monoklonální myší protilátkou
vůči FSH. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní
nenavázané složky. Přidá se druhá kozí protilátkou vůči FSH značená ALP. Po
inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky.
Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné
množství FSH. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,2
– 200 U/l. (po ředění 2x až do 400 U/l). Preciznost v sérii je 3,1 – 4,3
%, mezi sériemi 4,3 – 5,6 %. Linearita ředění ±3,43 %. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Chemiluminiscenční
analýza v sendvičovém provedení, kdy FSH ze vzorku se váže na myší
monoklonální protilátku vůči FSH zakotvenou v jamce. Po inkubaci (1 h, 37 °C,
třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální
protilátka vůči FSH značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (1 h, 37 °C,
třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát
luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný
acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě
šestibodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci FSH ve vzorku a odečítá se
mezi 5. a 15. min. Rozsah měření 0,2 – 200 U/l (vyšší koncentrace FSH jsou
automaticky ředěné 20x). Analytická senzitivita 0,2 U/l, funkční senzitivita
0,66 U/l. Preciznost v sérii ≤ 3,1 %, mezi sériemi je ≤ 7,8 %;
linearita ředění 86 – 114 %, zpětný výtěžek 90 – 119 %.
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza
v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI
zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální
biotinylované protilátky vůči FSH. První reagencie (Chemibeads) je potažena
monoklonální protilátkou vůči FSH a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá
reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační
barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii
Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální
protilátka-FSH-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie
Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma
částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii
Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads
a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce
612 nm a je přímo úměrný hladině FSH ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C.
Rozsah metody je 0,2 – 200 U/l (ředění se nedoporučuje). Detekční limit je 0,2
U/l. Preciznost
v sérii 1,4 – 1,9 %, mezi sériemi 2,2 – 2,7 %. Zpětný výtěžek 95 – 102 %,
linearita ředění 89,2 – 108,7 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do
40000 U/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus
neruší. RF 500 kU/l snižuje výsledek FSH o 13,5 %.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (40 µl) je inkubován
s monoklonální myší protilátkou vůči FSH značenou ruthéniovým komplexem a
biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči FSH. Pak se přidají
paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže
imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící
komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině FSH ve vzorku.
Metoda je použitelná v rozsahu 0,1 – 200 U/l. Ředění není nutné. Analytická
citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,1 U/l. Preciznost v sérii 1,4 – 2,0
%, mezi sériemi 2,9 – 5,3 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 2250 kU/l)
neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se
neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku
antigenu nebyl pozorován do 2000 U/l.
Referenční materiál nese označení WHO 2nd IS 94/632.
Toleranční limit EHK: 15 %.
Interference
Hodnoty snižuje: tělesné cvičení, obezita, pooperační stavy, estradiol,
testosteron, slepota, před pubertou, práce s olovem, transplantace ledvin.
Hodnoty zvyšuje: chronický alkoholismus (až o 20 %), dioxin, ozařování,
věk > 65 let, ovulace, menopauza, kouření, bolesti hlavy, puberta,
hladovění.
V moči hodnoty zvyšuje hladovění a vegetariánství.
Všechny imunoanalýzy mají nespecifickou odezvu na přítomnost
heterofilních protilátek.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28