Stanovení fragmentu cytokeratinu 19 (CYFRA 21-1)
Synonyma
CYFRA 21-1 antigen, CYFRA 1-21, cytokeratin 19 fragment, cytokeratin 19
fragment protein, CYFRA 19, keratin 19,
CK-19, K-19, KRT-19, Type I cytoskeletal 19
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparin,
EDTA). Stabilita vzorku 2 d při 20 – 24 °C, 7 d při 4 – 8 °C, 6 měsíců při – 20
°C. Opakované zamrazení se nedoporučuje, ale jinde se píše, že proces lze 3x
opakovat.
Poznámky k analytické
metodě
IRMA je sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do zkumavek
potažených monoklonální protilátkou vůči CYFRA 21-1, pak se přidá druhá
monoklonální protilátka vůči CYFRA 21-1 značená 125I. Po inkubaci
(20 h, 2 – 8 °C) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min).
Rozsah metody na základě pětibodové kalibrace je 0,05 – 60 (jiná metoda 0,11 – 110) µg/l; analytická
citlivost 0,05 (0,11) µg/l, funkční citlivost 0,5 µg/l. Preciznost
v sérii je 3,1 – 4,6 %, mezi sériemi 5,5 – 5,7 %; zpětný výtěžek 95 – 110 (80,7 – 102) %, linearita
ředění 81,1 – 119 %). Efekt
nadbytku antigenu se projevuje při 1700 µg/l. Stanovení ruší hemolýza,
lipémie, zákal.
ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou monoklonální
protilátkou vůči CYFRA 21-1 (některé
testy používají destičku potaženou streptavidinem a biotinylovaná Ab se zakotví
až během testu). Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a druhá monoklonální
protilátka vůči CYFRA 21-1 označená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (60 min)
se roztok odsaje a jamky 3x promyjí.
Dále se přidává tetrametylbenzidin, inkubuje se 15 min (lze měřit absorbanci při 620 nm bez přidání
stop činidla) a následně stop činidlo (0,5 M H2SO4).
Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Měření se provádí při 450±10 nm
(eventuelně 405 nm) do 10 min na
základě pětibodové (nebo šestibodové)
kalibrace v rozmezí 0,15 – 50 µg/l. Preciznost v sérii 4,5 – 6,9 %,
mezi sériemi 8,8 – 9,3 %. Zpětný výtěžek 89,6 – 102,3 %, linearita ředění 91,1
– 112,2 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Analytická citlivost je 0,15
µg/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 250 µg/l. Pokud se analyzuje
plazma, nutno použít heparin (citronan výsledky snižuje, EDTA silně zvyšuje).
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE
(time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál
se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Inkubace trvá 19 min. Měřený signál je po
sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek
k CYFRA 21-1) přímo úměrný hladině CYFRA 21-1. Na základě jednobodové
kalibrace je rozsah měření 0,15 – 35 µg/l (po automatickém ředění až do 4000
µg/l). Analytická citlivost je 0,15 µg/l, funkční citlivost 0,4 µg/l. Efekt
nadbytku antigenu se neprojevuje do 4000 µg/l. Preciznost v sérii 1,7 –
3,6 %, mezi sériemi 5,8 – 8,6 %. Hemoglobin neruší do 5 g/l, triacylglyceroly
do 9 mmol/l, bilirubin nevadí. Linearita ředění je 90 – 110 %.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči KS 19.1 zakotvenou na
paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po
inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči
BM 19.21 značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá
1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá
chemiluminiscence je přímo úměrná hladině CYFRA 21-1 a
sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje
měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,5 – 100
µg/l (Vzorky s hodnotami CYFRA 21-1 > 100 µg/l lze automaticky nebo manuálně
ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 5x). Preciznost
v sérii je 1 – 3 %, celkově 2 – 6 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového
kalibrátoru) 0,5 µg/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 750 µg/l.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém
uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s monoklonální myší
protilátkou vůči CYFRA 21-1 značenou ruthéniovým komplexem a biotinylovanou
monoklonální myší protilátkou vůči CYFRA 21-1. Pak se přidají paramagnetické
mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou
biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se
mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se
odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CYFRA 21-1 ve vzorku. Metoda je
použitelná v rozsahu 0,1 – 500 µg/l . Ředění při vyšších koncentracích 2x.
Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,1 µg/l. Preciznost v
sérii 1,1 – 2,1 %, mezi sériemi 1,9 – 4,7 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF
(< 1500 kU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5
mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu.
Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 2000 µg/l.
K dispozici je postup TRACE a chemiluminiscence s POD
markerem, ale podrobnosti nejsou volně dostupné.
Toleranční limit EHK: 15 %.
Interference
Míchání na vibrační míchačce způsobuje pokles naměřených hodnot.
Heterofilní protilátky ve vzorcích lidského původu
mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobují
interferenci v analýzách in vitro.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28