Stanovení free beta-hCG
Synonyma
choriogonadotropin – volná beta podjednotka;
free beta-human chorionic gonadotropin, free chorionic gonadotropin beta subunit, free hCG-b; free
beta-HCG; free beta-HCG protein, free b-HCG protein
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans EDTA, heparin
nebo citronan) nebo moči. Stanovení v séru vyžaduje rychlé zpracování (při
15 – 25 °C po 48 h vzestup o 10 – 20 %), případně stabilizaci jodacetátem
sodným (5 mmol/l), kdy je hodnota free beta-hCG stálá až 72 h. Stabilita
v séru: 1 – 9 d při 4 °C, 3 měsíce při -28 °C. Jinde uveden (Young)
vzestup v celé krvi při 4 °C: 2d 10 %, 3d 10 – 20 %, 5d 15 – 40 %.
Poznámky k analytické
metodě
IRMA volné
β-podjednotky hCG je založeno na dvoukrokové sendvičové metodě. Systém
používá dvě myší monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům přístupným
pouze na volné β-podjednotce molekuly hCG, které si vzájemně nekonkurují.
Nejprve se ve zkumavkách potažených první monoklonální protilátkou inkubují
vzorky nebo kalibrátory ve fosfátovém pufru (1 h, třepání). Po inkubaci se
obsah zkumavek odsaje a pipetuje se do nich druhá protilátka značená 125I.
Po druhé inkubaci (30 min, třepání) se odsaje obsah zkumavek a vymyje se
nenavázaná značená protilátka. Vázaná aktivita 125I se měří na
gama-počítači (1 min). Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Sestrojí se
šestibodová kalibrační křivka a hodnoty volného β-hCG přítomné ve vzorcích
se odečtou z této křivky. Koncentrace volného β-hCG ve vzorcích je přímo
úměrná změřené radioaktivitě. Rozsah metody 0,05 – 200 µg/l. Analytická
citlivost 0,05 µg/L, funkční citlivost 0,15 µg/l. Preciznost v sérii
≤ 3,7 %, mezi sériemi ≤ 4,2 %; linearita ředění 81 – 107 %, zpětný
výtěžek 77 – 118 %.
ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se
zakotvenou monoklonální myší protilátkou vůči free β-hCG. Do jamky se
přidá standard nebo vzorek a inkubuje se 30 min při 37 °C. Následuje 5x promytí
a pak se přidá králičí protilátka (některé
soupravy používají monoklonální myší protilátku) vůči free β-hCG s
navázanou křenovou peroxidázou. Po inkubaci 30 min při 37 °C (obě inkubace v některých soupravách
trvají dvojnásobnou dobu) a promytí 5x se přidá chromogen
tetrametylbenzidin a reakce probíhající 20 min je zastavena stop činidlem (0,5
M H2SO4). Měření se provádí při 450±10 nm do 15 min. Ruší
silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Neruší vysoké
koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani triacylglycerolů. Rozsah měření na
základě šestibodové kalibrace je 0,2 – 200 µg/l. Analytická citlivost je 0,2
µg/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 19800 µg/l. Preciznost
v sérii je 5,8 – 6,9 %, mezi sériemi 6,7 – 8,0 %. Linearita ředění 92,9 –
113,0 %, zpětný výtěžek 86,2 – 109,4 %.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE
(time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál
se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 19 min mezi free
β-hCG ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči free β-hCG značenou Eu3+
a monoklonální protilátkou vůči free β-hCG, která je připojena na sběrný
protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených
monoklonálních protilátek k free β-hCG) přímo úměrný hladině free
β-hCG. Analytická citlivost je 0,16 µg/l, funkční citlivost 0,5 µg/l. Na
základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,16 – 150 µg/l, po automatickém
ředění až 50000 µg/l. Preciznost pro koncentrace ≥ 0,5 µg/l: v sérii
2 – 10 %, mezi sériemi 3 – 15 %. Hemolýza, chylozita a ikterus neruší, pokud
jsou výsledky > 5 µg/l free β-hCG.
DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená
fluorescence Eu3+ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu3+
do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Komerčně dostupná je souprava
umožňující současně stanovovat AFP i free β-hCG. Mikrotitrační destičky
jsou potaženy směsí protilátek proti AFP a free β-hCG. Po pipetování
vzorku se přidají protilátky vůči AFP značené Eu3+ a free β-hCG značené Sm3+. Po
inkubaci (1 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí, pak se přidá
zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu3+
emise 613 nm, Sm3+ emise 643 nm) je přímo úměrná koncentraci analytů
ve vzorku a měří se do 1 h. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody 1
– 500 kU/l AFP, 1 – 200 µg/l free β-hCG. Analytická senzitivita je pro AFP
0,1 kU/l, pro free β-hCG 0,2 µg/l. Preciznost v sérii AFP 2,9 – 5,7
%; free β-hCG 2,0 – 14,6 %. Preciznost mezi sériemi AFP 3,0 – 4,8 %; free
β-hCG 1,9 – 19,3 %.
K dispozici je také souprava DELFIA pouze pro free β-hCG.
AlphaLISA je postup, kdy se
do mikrotitrační destičky pipetuje vzorek, pak se přidá akceptorová
kulička potažena protilátkou vůči free β-hCG a druhá volná protilátka vůči
free β-hCG s biotinylovou kotvou. Proběhne inkubace 15 min při 37 °C.
Přidá se donorová kulička potažena streptavidinem a proběhne druhá inkubace 15
min při 37 °C ve tmě. Takto vznikne komplex, kde donorová kulička po ozáření
680 nm uvolní singletový kyslík, který vyvolá fluorescenci akceptorové kuličky
615 nm. Rozsah měření do 200 µg/l, analytická citlivost 0,11 µg/l. Preciznost
v sérii 1,3 – 2,5 %, mezi sériemi 3,4 – 5,5 %; linearita ředění 98 – 108
%.
Chemiluminiscenční analýza
je založena na sekvenční imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. Free
β-hCG se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže
jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové
kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop free β-hCG s
polyklonální kozí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce
probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a
promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje
stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se
ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita
záření je přímo úměrná koncentraci free β-hCG ve vyšetřovaném vzorku.
Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a
vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 2 – 200
µg/l. Vzorky s koncentrací free β-hCG vyšší než 200 µg/l se ředí
diluentem manuálně. Analytická citlivost 1 µg/l (2 SD), funkční citlivost: 2
µg/l (CV ≤ 20 %). Preciznost v sérii 2,5 – 6,1 %, celková 6,5 – 11,3
%. Zpětný výtěžek: 97 - 113 %, linearita
ředění 88 – 102 %. Efekt nadbytku antigenu se do 133 735 µg/l neprojevuje.
Hemolýza může rušit stanovení. Hemoglobin do koncentrace 6,0 g/l, bilirubin do
koncentrace 342 µmol/l a
triacylglyceroly do 33,9 mmol/l neinterferují.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou
(ECLIA)v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován
s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči free β-hCG a
monoklonální myší protilátkou vůči free β-hCG značenou ruthéniovým
komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické
mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi
pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky,
kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky
se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu
vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci free β-hCG ve vzorku.
Chylozita, hemolýza, ikterus a RF (< 1000 kIU/l) neruší. Od pacientů
léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat
vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v
rozsahu 0,1 – 190 µg/l (ředění 10x automaticky, pak lze měřit koncentrace do
1900 µg/l, ale skutečná koncentrace po ředění musí být > 19 µg/l. Analytická
senzitivita je 0,1 µg/l, funkční senzitivita 0,5 µg/l. Preciznost v sérii CV
1,0 – 2,6 %, mezi sériemi 1,2 – 2,9 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje
do 800 µg/l.
Mezinárodní standard 1st IRP WHO 75/551.
Toleranční limit EHK: 20 %.
Interference
Hodnoty snižuje: kouření (pokles až o 21 % oproti nekuřačkám v 1.
trimestru).
Hodnoty zvyšuje: transport v teple, těhotenství (zvláště
vícečetné).
Heterofilní protilátky mohou interferovat u všech imunochemických metod.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28