Stanovení glutationtransferázy
Synonyma
Systematický název: RX:glutathion R-transferasa, EC 2.5.1.18;
Ostatní názvy: GST; glutathiontransferasa; glutathion-S-transferasa;
glutathion-S-alkyltransferasa; glutathion-S-aryltransferasa;
glutathion-S-aralkyltransferasa; S-(hydroxyalkyl)glutathionlyasa.
Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní
pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. V
anglickém názvosloví EC je kmenový základ někdy (např. S-aralkyltransferase) spojený
s názvem přenášené skupiny, jindy ale (např. transferase) může být samostatně.
Glutathione je v anglickém názvosloví vždy samostatně, v české verzi je
glutathion připojen ke kmenovému základu.
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo moči (střední prou druhé moče nebo
sběr za 24 h). Stanovení lze také provádět v tkáňových lyzátech nebo
kultivačních médiích. Odstřeďovat v chlazené centrifuze, vzorky dopravovat
na ledu, pro pozdější zpracování skladovat plazmu při -80 °C (stabilita 1
měsíc).
Poznámky k analytické
metodě
Fotometrie: Glutationtransferáza katalyzuje reakci mezi glutationem a
substrátem glutationtransferázy, tj. 1-chlor-2,4-dinitrobenzenem, který je
schopen detekovat širokou škálu izoenzymů GST (např. α, µ, p a jiné). Za určitých podmínek je interakce mezi glutationem a
substrátem úplně závislá na aktivitě GST. Takto vzniká dinitrofenyltioeter,
který lze detekovat při 340 nm. Detekční limit je 0,07 µkat/l. Analýza trvá 1 –
1,5 h. Postup lze provádět i v mikrotitračních destičkách.
V kinetické verzi trvá měření jen 5 min (rozsah měření 0,4 – 2,1 µkat/l;
absorbance se měří v minutových intervalech). Preciznost v sérii <
3,6 %, mezi sériemi < 4,8 %. Hemolýza při analýze ruší. Rovněž vadí některé
detergenty (např. polysorbát nebo CHAPS, tj.
3-[(3-cholamidopropyl)dimetylamonio]-1-propansulfonát) a proteázové inhibitory
(např. antipapain, leupeptin, trypsin, chymostatin).
K dispozici je i souprava s fluorescenční detekcí
(antrachinonové modře fluoreskující barvivo – monochlorbiman) pro vědecké účely
s citlivostí 0,008 µkat/l.
ELISA (sendvičový princip) na mikrotitračních destičkách má jamky
potažené protilátkou vůči GST. Vzorek nebo standard se během inkubace (2 h,
třepání) váže na protilátku. Po trojnásobném promytí se přidá primární detekční
protilátka a opět se inkubuje (1h, třepání). Po trojnásobném promytí se přidá
druhá detekční protilátka, značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (1 h,
třepání) a trojnásobném promytí se přidá tetrametylbenzidin a vzniklé modré
zbarvení se měří ihned kineticky při 600 nm, nebo se provede okyselení 1 M HCl
a vzniklé žluté zbarvení se měří při 450 nm. Signál je přímo úměrný koncentraci
GST. Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Detekční limit pro měření
koncentrace enzymu je 1 µg/l. Sedmibodová kalibrace umožňuje měřit
v rozsahu 9 – 400 µg/l. Preciznost v sérii 8,5 %, mezi sériemi 4
%. Linearita ředění je 78,4 – 126 %.
Zpětný výtěžek podle typu použitého pufru 63 – 94 %.
Postup lze také výrazně zkrátit. Vzorek a druhá biotinylovaná protilátka
se přidávají hned za sebou. Po inkubaci (30 min, 37 °C) a čtyřnásobném promytí
se přidá streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidázou a inkubuje se 15
min při 37 °C. Přidá se tetrametylbenzidin a reakce se po 15 – 20 min zastaví
stop činidlem. Detekční limit pro měření koncentrace enzymu je 1 µg/l.
V tomto případě je rozsah měření 3,125 – 100 µg/l. Preciznost v sérii
je 5 %, mezi sériemi 10 %; zpětný výtěžek 85 – 115 %.
Interference
Vyšší hodnoty způsobuje halotan.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28