Stanovení heparinu
Synonyma
α-heparin, heparinsulfát, heparan sulfát, heparinová kyselina,
heparinate
Lipo-Hepin, Liquaemin
Poznámka: někdy se uvádějí (nesprávně) pod tímto názvem i soli heparinu
(draselná, lithná, sodná).
Preanalytická fáze
Odběr venosní krve do citronanu 1 h před a 3 – 4 h po injekci). Separaci
plazmy nutno provést do 1 h. Citrátová plazma je stabilní 2 h při 15 – 25 °C a
ve speciálních zkumavkách CTAD (citronan, teofylin, adenosin, dipyridamol) 4 h
při 15 – 25 °C, 4 týdny při -20 °C.
Poznámky k analytické
metodě
Fotometrie: Faktor Xa je během inkubační fáze testu inaktivován
antitrombinem III. Tato reakce je katalyzovaná heparinem. Dextran sulfát
uvolňuje heparin navázaný na přítomné faktory, a tudíž ho činí dostupným pro
stanovení. Množství faktoru Xa zbylého po inkubační fázi je možné stanovit v
kinetickém testu z nárůstu absorbance při 405 nm za použití chromogenního
substrátu (Z-asp-leu-gly-arg-ANBA-metylamid;
ANBA = 5-amino-2-nitrobenzoová kyselina; Z = glutamát nebo glutamin) při 37 °C.
Metodu lze provádět ve dvou verzích: kinetická (vzorek plazmy, antitrombinové
činidlo a činidlo faktor Xa se postupně dávkuje, promíchá a inkubuje 1 min při
37 °C; přidá se substrát a měří se ΔA/min) a dvoubodová (vzorek plazmy,
antitrombinové činidlo a činidlo faktor Xa se postupně dávkuje, promíchá a
inkubuje 1 min při 37 °C; přidá se substrát, promíchá se a po 1 min 20 %
kyselina octová, promíchá se a měří do 2 h proti blanku). Na základě
šestibodové kalibrace je rozsah měření 0,05 – 1 kU/l. Pokud je koncentrace
heparinu velmi nízká může být citlivost testu zvýšena prodloužením inkubační
doby na 3 min. Detekční limit metody je 0,05 kU/l. Preciznost v sérii je 4
– 7 %, mezi sériemi 6,9 – 7,1 %. Některé chromogenní metody mají rozsah měření
jen do 2 kU/l (po ředění do 10 kU/l). Barevná reakce se může zastavovat také
kyselinou citronovou.
Jiný postup využívá faktoru IIa. Heparin inhibuje koagulaci krve tím, že
se váže na antitrombin a vzniklý komplex inhibuje faktor IIa. Inhibice faktoru
IIa se může sledovat enzymově pomocí chromogenního peptidového substrátu
(His-Asp-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl; Pip = pipekolinová kyselina) na základě jeho
hydrolýzy zbytkem faktoru IIa. Změna zbarvení (vznik p-nitroanilinu) je tedy
nepřímo úměrná koncentraci heparinu. Opět jsou dvě verze: kinetická anebo
dvoubodová, kdy se barevná reakce zastavuje okyselením 20 % kyselinou octovou.
Rekalcifikační čas se sleduje tehdy, když se místo chromogenního
substrátu použije rekalcifikační činidlo. Faktor Xa je během inkubační fáze
testu inaktivován antitrombinem III. Tato reakce je katalyzovaná heparinem.
Dextran sulfát uvolňuje heparin navázaný na přítomné faktory, a tudíž ho činí
dostupným pro stanovení. Množství faktoru Xa zbylého po inkubační fázi je možné
stanovit jako rekalcifikační čas (čím více heparinu, tím bude rekalcifikační
čas delší). Rozsah měření je 0,03 – 100 kU/l. Preciznost v sérii je 0,78 –
1,05 %.
ELISA využívá sendvičový princip. Protilátka vůči heparinu je zakotvená
v jamkách a na ní se naváže heparin a konjugát protilátky vůči heparinu s
křenovou peroxidázou (inkubace 30 min, třepání). Po čtyřnásobném promytí a
reakci s tetrametylbenzidinem (4 – 30 min ve tmě) se po okyselení stop
činidlem detekuje žluté zbarvení při 450 nm. Celý postup se provádí za laboratorní
teploty. Rozsah metody je 0,3 – 100 kU/l.
Referenční materiál: WHO International Standard, 6th International
Standard for Unfractionated Heparin NIBSC 07/328.
Interference
Hodnoty snižuje: odběr do oxalátu, pozdní zpracování, kouření, uvolnění
destičkového faktoru 4 (vlivem nesprávného odběru nebo nesprávné centrifugace),
nedostatek antitrombinu III, protaminsulfát.
Hodnoty zvyšuje: odběr do EDTA.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28