Stanovení inzulinu
Synonyma
insulin, inzulín
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v nehemolytickém séru nebo plazmě (EDTA nebo
citrát sodný). Stabilita v séru i plazmě je stejná při 20 – 25 °C 4 h, při
4 – 8 °C 24 h, při -20 °C 24 týdny.
Vyšší hodnoty jsou ráno a dopoledne.
Poznámky k analytické
metodě
RIA v kompetitivním uspořádání, kdy inzulin ze séra a inzulin
značený 125I soutěží o vazebná místa na protilátce, kterou jsou
potaženy stěny polypropylenové zkumavky. Po inkubaci 3 h při 37 °C se provede
dekantace a vyklepání veškeré kapaliny za zkumavek. Následuje měření signálu
gama-počítačem, který je nepřímo úměrný koncentraci inzulinu ve vzorcích.
Preciznost v sérii CV < 15 %, mez detekce 3 mU/l. Při vysoké hodnotě
inzulinu se vzorek ředí nulovým kalibrátorem.
IRMA sendvičového
typu používá dvě myší monoklonální protilátky vůči insulinu Vzorky nebo standardy se inkubují 2 h za stálého
třepání při laboratorní teplotě ve zkumavkách potažených první protilátkou
společně s druhou protilátkou značenou 125I. Po inkubaci se obsah
zkumavek 2x promyje, aby se odstranila nenavázaná značená protilátka. Vázaná
aktivita 125I se poté měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace
inzulinu ve vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě a získá se interpolací
ze šestibodové kalibrační křivky. Rozsah stanovení je 0,5 – 300 mU/l.
Analytická citlivost je 0,5 mU/l, funkční citlivost 1,04 mU/l. Preciznost
v sérii 4,3 %, mezi sériemi 3,4 %. Linearita ředění byla 87 – 119 %,
zpětný výtěžek 94 – 107 %.
ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v
mikrotitrační destičce se zakotvenou monoklonální myší protilátkou vůči
inzulinu. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a monoklonální protilátka vůči
inzulinu s navázanou křenovou peroxidázou.
Po inkubaci (1 h, třepání) a promytí 3x se přidá chromogen
tetrametylbenzidin a reakce probíhající ve tmě 10 min (třepání) je zastavena
stop činidlem (0,46 M H2SO4). Měření při 450 nm nutno
provést do 30 min (možno i bichromaticky proti 620 – 650 nm). Celý postup se
realizuje za laboratorní teploty. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt
nadbytku antigenu. Neruší vysoké koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani
heterofilní protilátky. Rozsah měření na základě pětibodové kalibrace je 0,5 –
180 mU/l (jiné soupravy na podobném principu umožňují měřit až do 500 mU/l).
Preciznost v sérii je 5,1 – 7,5 %, mezi sériemi 4,2 – 9,3 %. Detekční
limit je 0,5 mU/l. Linearita ředění 86 – 104 %, zpětný výtěžek 94 – 98 %.
Křížová reaktivita s proinzulinem je 0,3 %.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální
protilátkou vůči inzulinu a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu
a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se druhá myší monoklonální
protilátka vůči inzulinu značená ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát
4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož
vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1 –
300 mU/l. Vzorky s koncentrací inzulinu >
300 mU/l se ředí manuálně 5x. Preciznost v sérii je 2,6 – 4,1 %, celková
preciznost metody je 4,0 – 5,3 % zpětný výtěžek 95,5 – 101 %. Senzitivita je 1
mU/l. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat
s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit
interference s in vitro imunologickým stanovením. Erytrocytární proteázy
při hemolýze mohou degradovat inzulin. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu,
bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita s proinzulinem je
0,016 %.
Chemiluminiscenční imunoanalýza
v sendvičovém uspořádání probíhá v jednom reakčním stupni. Standard
nebo vzorek se smíchají s paramagnetickými mikročásticemi potaženými myší
monoklonální protilátkou vůči lidskému inzulinu a s myší monoklonální
protilátkou vůči lidskému inzulinu značenou akridiniumkarboxamidem. Po promytí
fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu
sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci inzulinu a
sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda se
šestibodovou kalibrací dovoluje měřit vzorky v rozmezí koncentrací 1,0 –
300 mU/l. Vzorky s koncentrací inzulinu >
300 mU/l se ředí automaticky 2x. Preciznost v sérii 1,7 – 4,2 %, celkově 1,9 –
5,2 %. Zpětný výtěžek je 91,5 – 101,6 %. Analytická senzitivita (nulový blank)
je 1,0 mU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů
neruší. Metoda nevykazuje křížovou reakci s proinzulinem. Efekt nadbytku
antigenu se neprojevuje do 15000 mU/l.
Podobný princip
zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. První protilátka je monoklonální myší vůči inzulinu
značená esterem akridinu a pak se 5 min roztok inkubuje při 37 °C. Poté se
pipetuje druhá monoklonální myší protilátka vůči inzulinu, která je kovalentně
vázána na paramagnetické latexové částice a opět se inkubuje 3 min při 37 °C.
Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a
ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk
fotonásobičem při 429 nm. Vzorky s koncentrací
insulinu > 300 mU/l se ředí automaticky 2,5x. Při vysokých koncentracích
insulinu se projevuje efekt nadbytku antigenu. Mez detekce je 0,5 mU/l. Efekt nadbytku
antigenu se neprojevuje do 10,6 nmol/l. Preciznost v sérii 3,2 – 4,6 %,
mezi sériemi 6,3 – 7,5 %. Linearita ředění je 84,6 – 109,4 %, zpětný výtěžek
105,9 – 113,8 %. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat
s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit
interference s in vitro imunologickým stanovením. Neruší hemolýza do 1,25 g/l hemoglobinu,
triacylglyceroly do 11,3 mmol/l a bilirubin do 342 µmol/l.
CLIA je jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy se na
magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou naváže inzulin a
současně se na jeho další epitop připojí druhá monoklonální myší protilátka
značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 31,5 minut, po promytí se přidá
startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří
záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině inzulinu. Rozsah měření na
základě dvoubodové kalibrace je 0 – 500 mU/l. Analytická citlivost je 0,23
mU/l, funkční citlivost 0,61 mU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do
200000 mU/l. Preciznost v sérii 1,8 – 4,3 %, mezi sériemi 3,3 – 9,9 %.
Linearita ředění je 94,1 – 115 %, zpětný výtěžek 94,0 – 105,4 %. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou
reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a
způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Hemolýza,
chylozita ani ikterus neruší.
Jiné stanovení používá jako značku ALP. Inzulin se v prostředí
pufrovaného roztoku váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku
imobilizovanou na polystyrenové kuličce a druhým epitopem s polyklonální ovčí
protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou a třetím epitopem na
monoklonální myší protilátku, která je také značená ALP. Reakce probíhá 60
minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí
se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou
fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku
záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm
je přímo úměrná koncentraci inzulinu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou
stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena
na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Stanovení se provádí v intervalu 2 – 400
mU/l. Preciznost v sérii je 5,2 – 6,4 %, celková 5,9 – 8,0; zpětný výtěžek
84 -108 %, linearita ředění 88 – 115 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje
do 80000 mU/l. Fragment PTH 7-84 vykazuje křížovou reaktivitu přibližně 80 %.
Hemolýza neinterferuje, ale vysoký bilirubin zapříčiňuje snížení naměřených
hodnot. Rovněž ruší lipémie. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou
reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a
způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.
Jiný postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se
pipetuje myší monoklonální protilátka vůči inzulinu značená ALP a standard nebo
vzorek. Pak se přidají paramagnetické částice potažené myší monoklonální
protilátkou vůči inzulinu. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a
promytím odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát.
Rozsah měření při 470 nm je 0,03 – 300 mU/l (po ředění 10x 3000 mU/l).
Analytická citlivost (nulový kalibrátor) 0,03 mU/l. Linearita ředění je 91 –
112 %, zpětný výtěžek 89 – 104 %. Preciznost v sérii 2,0 – 4,2 %, celková
3,1 – 5,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů
neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat
s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit
interference s in vitro imunologickým stanovením.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou
(ECLIA)v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován
s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči inzulinu a
monoklonální myší protilátkou vůči inzulinu značenou ruthéniovým komplexem za
vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené
streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí
biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se
mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se
odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci inzulinu ve vzorku. Při
hemolýze erytrocytární peptidázy degradují inzulin. Chylozita, ikterus a RF
(< 18900 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj.
> 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního
podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,2 – 1000 mU/l. Reprodukovatelnost
v sérii CV 1,9 – 2,0 %, mezi sériemi 2,5 – 2,8 %. Efekt nadbytku antigenu se
neprojevuje do 20000 mU/l.
HPLC stanovení probíhá na reversní fázi C-18 (Hypersil BSD) za
laboratorní teploty s UV detekcí při 214 nm s mobilní fází
voda-acetonitril (3:2) při pH 3,2 (nastaveno pomocí H3PO4).
Metoda je ale málo citlivá (od 247 U/l), takže v klinické biochemii
prakticky nepoužitelná.
Toleranční limit EHK: 20 %.
Interference
Výsledky snižuje: hemolýza (vliv peptidáz erytrocytů), odběr do heparinu
(váže inzulin), tělesné cvičení, hladovění, redukční dieta, alkohol, oxalát,
serotonin. Léky: asparagináza, beta-blokátory, blokátory kalciového kanálu,
Cimetidin, Corinfar, Doxazosin, Diazoxid, Etakrynová kyselina, éter,
fenobarbital, fenformin, fenytoin, Furanthril, Furantral, Furosemid,
Hydrochlorothiazid, chlorpromazin, chlorpropamid, kalcitonin, klofibrát,
Metformin, Nifedipin, Pentamidin, propranolol, Sodanton, Streptozotocin.
Výsledky zvyšuje: obezita, kouření, podání glukagonu nebo glukózy,
acetoacetát, GLP 1 (glukagon like peptid l), zvýšení proinzulinu (křížová
reakce), vysoký věk, těhotenství, kontraceptiva. Léky: Albuterol, antibiotika
perorální, Astmopent, Beklometason, calcium, cyklosporin, Danazol,
desoxykortikosteron, Dirastan, Fentolamin, fruktóza, chinin, chinidin,
Chlorpropamid, Levedopa, Lipovitan, niacin, Nutramin (C, S, U), pankreozymin,
prednisolon, růstový hormon, Salbutamol, sekretin, spironolakton, Terbutalin,
Tolazolamid, Tolbutamid, Ventolin.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28