Stanovení kreatinkináza
izoenzym - MB
Synonyma
ATP:kreatin N-fosfotransferasa, EC 2.7.3.2;
CK-MB; CK-2; kreatinkináza MB; kreatinkinasa MB; kreatinfosfokináza MB;
kreatinfosfokinasa MB; fosfokreatinkinasa MB; kreatinfosfotransferasa MB; ATP:kreatinfosfotransferasa
MB; adenosintrifosfát-kreatintransfosforylasa; MB-CK.
Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní
pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Prof.
Kodíček uvádí celý název jako jedno slovo, v anglickém názvosloví EC je kmenový
základ (např. kinase) vždy samostatně.
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans pouze
heparin, ostatní inhibují enzymovou aktivitu). Všechna antikoagulancia schopna
tvořit cheláty inhibují aktivitu CK-MB, neboť maskují hořečnaté ionty
aktivující CK. Je třeba zabránit hemolýze. Slabá hemolýza (hemoglobin 0,32 g/l)
nezpůsobuje znatelnou změnu měřené aktivity CK-MB. Centrifugovat do 30 min od
odběru. Stabilita sérum i plazma: 20 až 25 °C 2 – 4 h, 4 až 8 °C 3 – 7 dní, -20
°C 4 týdny. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Fyzická zátěž hodnoty zvyšuje.
Neodebírejte po chirurgických výkonech a defibrilacích. Doporučuje se
skladování ve tmě. Analýzu může rušit bilirubin a zákal. Snížení aktivity CK
může způsobit denní světlo a také skladování při teplotách < 4 °C.
Pro delší skladování séra se doporučuje přidání tiolů, neboť redukují
sulfhydrylové skupiny CK a obnovují její aktivitu. Nejefektivnější tioly jsou
2-tioglycerol a 2-merkaptoetanol (obě kapaliny po 6 h skladování se vzorkem při
37 °C gelovatí a způsobují zákal). Nejčastěji se ale používá N-acetylcystein,
protože může být dodáván jako krystalická substance.
Poznámky k analytické
metodě
Kreatinkináza EC 2.7.3.2 katalyzuje přeměnu kreatininu
na kreatinfosfát.
Poločas vymizení: CK-MB 10-14 h.
Elektroforéza na agaru, agaróze nebo acetátu celulózy
umožňuje uspokojivě rozdělit jednotlivé izoenzymy. K vizualizaci se
použije obvyklá defosforylace kreatinfosfátu s následnou fosforylací
glukózy a vznikem redukčního produktu NADPH. Ten lze sledovat fluorescenční
denzitometrii (mez detekce 0,03 µkat/l). Protože tento způsob detekce není
obvykle k dispozici, lze použít NADPH k redukci tetrazoliových solí a
k detekci použít běžného denzitometru. Automatické elektroforetické
analyzátory mohou analyzovat 30 vzorků za 30 min, nebo 6 vzorků za 18 min.
Isoelektrická fokusace izoenzymů CK se provádí
v gradientu sacharózy na elektrofokusační koloně (110 ml) připojené ke
zdroji po dobu 36 h. Tím dochází k rozdělení až na 100 frakcí a jednotlivé
izoenzymy jsou pak přiřazovány na základě měření izoelektrického bodu a
stanovuje se aktivita jednotlivých frakcí.
Iontově-výměnná chromatografie využívá nejvíce 6 cm
kolonku s náplní DEAE-Sephadex A50. Po adsorpci jsou jednotlivé izoenzymy
vymývány roztoky NaCl v TRIS pufru s rozdílnou iontovou silou. CK-MB
se vymývá při koncentraci NaCl 200 mmol/l. Mez detekce metody je 0,02 µkat/l.
Imunochemické úpravy používají specifická antiséra proti
M a B podjednotkám.
Imunoprecipitace používá obvykle kozí antisérum proti B
podjednotce. Tím se vysráží CK-BB a CK-MB a běžnou metodikou pro celkovou CK se
stanoví CK-MM. Podobně se antisérem proti M podjednotce vysráží CK-MM a CK-MB a
běžnou metodikou pro celkovou CK se stanoví CK-BB (pokud je přítomná). Jestliže
se od aktivity CK odečtou zbytkové aktivity po blokování obou podjednotek,
získáme aktivitu CK-MB. Mez detekce metody 0,07 µkat/l.
Imunoinhibice
je jednodušší a rychlejší než imunoprecipitace. Je to prakticky jediná běžně
používaná metoda pro stanovení aktivity CK-MB. Antisérum vůči podjednotce M
(myší monoklonální protilátka) inhibuje obě podjednotky CK-MM a M podjednotku
CK-MB. Stanovujeme tedy B podjednotku CK-MB (tj. polovinu izoenzymu), pokud
není CK-BB přítomna (většinou není přítomná a pokud ano je její aktivita <
0,08 µkat/l). Analýza je aktivována N-acetylcysteinem. Mez detekce metody je
0,07 µkat/l. Rozsah měření je 0,17 – 33,3 µkat/l (vyšší aktivity lze ředit 3x).
Inhibiční kapacita protilátky je až do 133,3 µkat/l CK-MM. Preciznost
v sérii 0,54 – 4,03 %, celkem 0,90 – 5,05 %.
Hlavním interferentem při reakci je adenylátkináza
(synonymum myokináza), která se hojně vyskytuje v erytrocytech. Tento
enzym katalyzuje konverzi dvou molekul ADP na ATP + AMP. Protože při stanovení
aktivity CK-MB sledujeme ATP vzniklý po defosforylací kreatinfosfátu, způsobuje
adenylátkináza falešně vysoké výsledky měření. Aktivita adenylátkinázy 10
µkat/l odpovídá aktivitě CK 1 µkat/l. Nejefektivnějším inhibitorem adenylátkinázy
je směs 5 mmol/l AMP a 10 mmol/l diadenosin-5-pentafosfátu. Specifickým
inhibitorem je i fluorid sodný, ale při vyšších koncentracích Mg2+
vzniká sraženina fluoridu hořečnatého.
Lipémie do 11,3 mmol/l triacylglycerolů neruší.
Certifikovaný referenční materiál není zatím
dostupný.
Interference
Snížené aktivity CK-MB: EDTA, fenotiaziny,
fluoridy, heparinát lithný, perorální kontraceptiva, prednison, dobesilát
vápenatého, hydroxykobalamin, aj.
Řada látek způsobuje zvýšení aktivity CK-MB: adenylátkináza, amfetamin, amfotericin B, amitriptylin, amoklen, ampicilin,
β-antagonisté, antihypelipidemika, barbituráty,
cimetidin, cyclopropan, dalacin, danazol, dexametason, diazepam, dietyleter, digoxin, dipidolor, dolsin, etanol, etretinát, fenatyl, fenytoin, furosemid,
gemfibrizol, halofenát, haloperidol, halotan, heroin, chinidin,
chlorpromazin, chlortalidon, insulin, isotretinoin, kaptopril, karbenoloxon, klindamycin, klofibrát, klonidin, klopamid, kolchicin,
kyselina acetylsalicylová, kyselina aminokapronová,
labetalol, lidokain, lithium, morfin, D-penicilamin, perfenazin, pindolol, prochlorperazin, propranolol, salicyláty, sekobarbital,
stanozolol, steroidy, streptokináza, sukcinylcholin, teofylin, tricyklická
antidepresiva aj.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28