Stanovení
lutropinu (LH)
Synonyma
luteinizační hormon; Luveris;
interstitial
cell-stimulating hormone, ICSH
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans heparin) nebo
moči (obvykle odpad za 24 h). Při použití EDTA jsou výsledky v plazmě
vyšší! Stabilita analytu v séru 1 – 7 d při 20 – 25 °C, 2 – 14 d při 4 – 8
°C, 1 – 60 měsíců při -20 °C. Opakované rozmrazování se nedoporučuje. Sérum lze
posílat poštou bez chlazení.
Vzorky moče by neměly obsahovat stabilizátory a doporučuje se uchování
při -20 °C.
U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního
cyklu. Je vhodné uvést den cyklu.
Poznámky k
analytické metodě
K dispozici jsou stanovení, která umožňují simultánně vyšetřit FSH
a LH (s markery 57Co-LH + 125I-FSH nebo Eu3+-LH
+ Tb3+-FSH).
Koncentrace LH v séru se může změnit během 20 min až trojnásobně,
proto se zejména v pediatrii dává přednost sběru moče za 3 h (výkyvy se
vyrovnají) a 80násobnému zahuštění vzorku.
RIA v sekvenčním uspořádání, kdy v prvním kroku reaguje LH ze
vzorku se specifickou protilátkou a v následné inkubaci se pak přidá LH
značené 125I, není již v komerční soupravě na trhu. I když se
oba inkubační kroky podařilo výrazně zkrátit (30 + 60 min), je specifita reakce
vzhledem k podobnosti gonadotropinů neuspokojivá (interference hCG je 10 –
25 %).
IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním ředěného
séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči LH a přidáním
druhé protilátky vůči LH značené 125I. Po inkubaci (90 min,
laboratorní teplota, třepání; nebo 2 h)
se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Navázaná
aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Na základě šestibodové kalibrace je
rozsah metody 0,2 – 180 U/l (při vyšších hodnotách se provádí ředění nulovým
kalibrátorem); analytická citlivost 0,2 U/l, funkční citlivost 0,4 U/l.
Preciznost v sérii je ≤ 6,7 %, mezi
sériemi ≤ 3,7 %. Linearita ředění 83 – 113 %, zpětný výtěžek
100 – 126 %. Interference hCG je < 0,008 %.
ELISA používá dvou
protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou (může být kozí polyklonální) a druhá (myší monoklonální) má biotinylovou kotvu. Mikrotitrační jamky jsou
potaženy streptavidinem (v některých
soupravách je monoklonální protilátka zakotvena přímo v jamkách). Po
inkubaci 1 h (nebo 45 min) a
dvojnásobném (nebo 5x) propláchnutí
se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 15 min ve tmě. Pak se přidá
stop činidlo (0,15 M H2SO4) a měří se při 450 nm (obvykle do 15 min), kdy absorbance je
přímo úměrná koncentraci LH. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty.
Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,5 – 200 U/l (některé soupravy jen do 50 U/l, jiné až do
240 U/l). Mez detekce je 0,5 U/l. Preciznost v sérii je ≤ 9,21
%, mezi sériemi ≤ 7,91. Zpětný
výtěžek 90 – 104 %, linearita ředění
86 – 109 %. Efekt nadbytku antigenu
se neprojevuje do 2500 U/l.
Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené
myší monoklonální protilátkou vůči β-LH. Po inkubaci se reakční směs
přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí
polyklonální protilátka vůči α-LH značená ALP v pufru TRIS. Po
inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí
na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky.
Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,5 – 250 U/l. (Vzorky s hodnotami LH
> 250 U/l lze manuálně ředit 2x – hodnota po ředění musí být > 5 U/l).
Preciznost v sérii je 3,85 – 6,33 %, celková preciznost metody je 4,42 –
8,49 %. Zpětný výtěžek 92 – 105 %. Analytická senzitivita je 0,5 U/l. Ani
vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová
reaktivita TSH 3,5 %, ostatní ≤ 0,2 %.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována
jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Měřený signál je přímo úměrný hladině LH. Souprava
už není na trhu.
DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence
Eu3+ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu3+
do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách
je zakotvena protilátka vůči LH. V sendvičovém uspořádání se pipetuje LH
ze vzorku a specifická protilátka značená Eu3+. Po inkubaci a
promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty.
Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci LH ve
vzorku a měří se do 1 h. Mez detekce metody je 0,05 U/l. Rozsah metody 0,05 –
250 U/l. Preciznost v sérii > 10 % (při koncentracích < 1,5 U/l) a
< 7% (při koncentracích ≥ 1,5 U/l), mezi sériemi ~9,3 %.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči β-LH zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které
se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem
se přidá myší monoklonální protilátka vůči α-LH
značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá
1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá
chemiluminiscence je přímo úměrná hladině LH a sleduje se fotonásobičem při 429
nm. Metoda dovoluje měřit vzorky na základě
šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,5 – 250 U/l (Vzorky s hodnotami
LH > 250 U/l lze automaticky nebo manuálně ředit 4x; po ředění musí být
hodnota > 2 U/l). Preciznost v sérii je 1,7 – 3,6 %, celkově 2,4 – 8,9
%. Zpětný výtěžek 86,5 – 116,2 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového
kalibrátoru) 0,03 U /l, funkční senzitivita 0,09 U/l. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Podobný princip zábleskové
luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku
pacientského séra se přidá monoklonální myší protilátka vůči LH značená
esterem akridinu. Po inkubaci 5 min při 37 °C se přidá a monoklonální myší
protilátka vůči LH kovalentně na paramagnetické částice ve
fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C
následuje
odsátí roztoku a promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a
ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na
základě šestibodové kalibrace v rozmezí 0,07 – 200 U/l. Vzorky
s hladinou LH > 200 U/l se ředí 2x automaticky nebo manuálně jsou-li
hodnoty > 400 U/l. Analytická citlivost je 0,07 U/l. Preciznost v sérii 2,3 – 3,0 %, mezi sériemi 1,5
– 2,9 %. Linearita ředění je 80,3 – 100,4 %, zpětný výtěžek 97,3 – 115,8 %.
Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Efekt nadbytku antigenu se při
měření může projevit kolem 18000 U/l.
CLIA je další jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy na
magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže LH a
současně se na jeho další epitop připojí druhá myší monoklonální protilátka
značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 10 minut, po promytí se přidá startér
(0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk.
Intenzita signálu je přímo úměrná hladině LH. Rozsah měření na základě
dvoubodové kalibrace je 0,2 – 250 U/l. Analytická citlivost je 0,2 U/l, funkční
citlivost 0,4 U/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 80000 U/l.
Preciznost v sérii je 1,5 – 6,8 %, mezi sériemi 2,2 – 9,0 %. Linearita
ředění je 100 – 103 %, zpětný výtěžek 96 – 104 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly.
Jiné stanovení je založeno
na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem.
LH se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší
monoklonální protilátku vůči LH imobilizovanou na polystyrénové kuličce a
současně se na druhé vazebné místo LH naváže polyklonální kozí protilátka vůči
LH konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po
odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem.
Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině LH ve vyšetřovaném
vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a
vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 200
U/l, avšak do hodnoty 85000 U/l nebyl pozorován efekt nadbytku antigenu.
Analytická citlivost je 0,05 U/l. Preciznost v sérii 3,4 – 13,1 %, celková
6,1 – 26,3 %; zpětný výtěžek 98 – 113 %, linearita ředění 75 – 108 %. Neinterferují
bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky
se pipetuje standard nebo vzorek obsahující LH a paramagnetické částice
potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG s navázanou monoklonální myší
protilátkou vůči LH. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím
odstraní nenavázané složky. Přidá se druhá kozí protilátkou vůči LH značená
ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané
složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo
úměrné množství LH. Reagencie se musí skladovat při 2 – 10 °C. Rozsah měření
při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,2 – 250 U/l. (po ředění 2x až
do 500 U/l). Analytická citlivost 0,2 U/l. Preciznost v sérii je 3,8 – 5,4
%, celková 4,3 – 6,4 %. Linearita ředění 96,9 – 107,6 %. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Chemiluminiscenční
analýza v sendvičovém provedení, kdy LH ze vzorku se váže současně na ovčí
biotinylovanou protilátku vůči LH a myší monoklonální protilátka vůči
beta-podjednotce LH značenou křenovou peroxidázou. Imunokomplex se
zakotví v jamce potažené streptavidinem. Po inkubaci (16 min, 37 °C,
třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát
luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný
acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě
šestibodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci LH ve vzorku a odečítá se
mezi 5. a 15. min. Rozsah měření 0,216 – 200 U/l (ředění vyšších hodnot pouze
manuálně). Analytická senzitivita 0,0367 U/l, funkční senzitivita 0,216 U/l.
Preciznost v sérii 1,0 – 8,8 %, mezi sériemi je 1,5 – 11,3 %. Efekt
nadbytku antigenu se neprojevuje do 5000 U/l.
Hladiny biotinu zůstávají zvýšené do 24 h od podání.
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na
technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích
a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči LH. První reagencie
(Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči LH a obsahuje
chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem
a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou
protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy
částice-monoklonální protilátka-LH-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány
reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy
s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z
reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii
Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při
vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný hladině LH ve vzorku. Analýza trvá 10 min
při 37 °C. Rozsah metody je 0,2 – 150 U/l (ředění se nedoporučuje). Analytická
citlivost je 0,1 U/l, funkční citlivost je 0,2 U/l. Preciznost
v sérii 1,2 – 2,4 %, mezi sériemi 1,8 – 3,0 %. Zpětný výtěžek je 99,2 –
105,5 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 U/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší. Reagencie nutno
skladovat při 2 – 8 °C.
Stanovení elektrochemiluminiscenční
imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20
µl) je inkubován s monoklonální myší protilátkou vůči LH značenou
ruthéniovým komplexem a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči LH.
Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se
naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící
komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině LH ve vzorku.
Metoda je použitelná v rozsahu 0,1 – 200 U/l. Ředění není nutné. Analytická
citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,1 U/l. Preciznost v sérii 0,6 – 1,8
%, mezi sériemi 1,6 – 5,2 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 1500 kU/l)
neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se
neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku
antigenu nebyl pozorován do 1150 U/l. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci
způsobenou velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu.
Referenční materiál nese označení WHO 2nd IS 80/552.
Toleranční limit EHK: 15 %.
Interference
Hodnoty snižuje: tělesné cvičení, hladovění, obezita, vegetariánství,
stres, sálající teplo, kouření, pooperační stavy, slepota, dopamin, marihuana,
práce s olovem, transplantace ledvin.
Hodnoty zvyšuje: chronický alkoholismus, dioxin, věk > 65 let,
menopauza, bolesti hlavy, puberta, sezónní výkyvy světla.
V moči hodnoty zvyšují hladovění, ovulace a vegetariánství.
Všechny imunoanalýzy mají nespecifickou odezvu na přítomnost
heterofilních protilátek.
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28