Stanovení morfinu
Synonyma
Systematické názvy:
7,8-didehydro-4,5-α-epoxy-17-methylmorphinan-3,6-α-diol,
7,8-didehydro-4,5-epoxy-17-methyl-(5α,6α)-morphinan-3,6-diol,
Preanalytická fáze
Při průkazu morfinu v moči je třeba zabránit manipulaci se vzorkem. Také
kvantitativní analýzy se provádějí zpravidla v moči.
Citronan a oxalát snižují naměřené hodnoty morfinu.
Poznámky k
analytické metodě
Imunochemické metody většinou stanovují sumu opiátů, kdy morfin je
nejvýznamnějším z alkaloidů opia.
Hemaglutinační
inhibice je založena na kompetici stabilizovaných erytrocytů s navázaným
opiátem a opiátu ze vzorku o vazebná místa aglutinační protilátky. Inhibice
aglutinace odpovídá koncentraci opiátů ve vzorku. Metoda nevyžaduje extrakci a
je citlivá, ale nespecifická. Analýza trvá 1 h. Mez detekce je 560 nmol/l
morfinu.
RIA specifická pro
morfin musí nejdříve odstranit morfin-3-glukuronid extrakcí do chloroformu. Pak
následuje kompetice (30 min, laboratorní teplota) mezi morfinem ze vzorku a
morfinem značeným 125I o vazebná místa na kozí protilátce. Pak se
imunokomplex sráží 10 min sérem proti kozímu imunoglobulinu. Po centrifugaci a
dekantaci se měří radioaktivita sraženiny 1 min gama-počítačem. Signál je
nepřímo úměrný koncentraci morfinu. Rozsah měření je 35 – 350 nmol/l morfinu.
Preciznost v sérii 1,1 – 2,1 %, mezi sériemi 2,6 – 4,4 %.
Homogenní enzymová
imunoanalýza využívá myší monoklonální
protilátky, které detekuji opiáty v moči na základě kompetice o daný počet
specifických vazebných míst na protilátkách mezi drogou značenou enzymem a
drogou v moči. Není-li droga ve vzorku přítomna, naváže se specifická
protilátka na drogu značenou glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6PDH) a dojde
k inhibici aktivity enzymu. Toto uspořádání vytváří přímý vztah mezi
koncentraci drogy v moči a enzymovou aktivitou. Enzymová aktivita G6PDH je
stanovena spektrofotometricky při vlnové délce 340 nm / 412 nm měřením
schopnosti přeměňovat NAD+ na NADH. Na základě čtyřbodové kalibrace
(pětibodová EMIT metoda je velmi podobná)
je měřicí rozsah metody 36,1 – 3505 nmol/l (po ředění 6x 155 – 21000 nmol/l). Při nastavení
cut-off lze automaticky hodnotit výsledky jako pozitivní či negativní. Celková preciznost 1,3 – 2,8 %; zpětný výtěžek
90,2 – 106,9 %.
ELISA je kompetitivní postup na mikrotitračních destičkách, kdy soutěží
morfin ze vzorku (ředěný fosfátovým pufrem) s morfinem značeným křenovou
peroxidázou o vazebná místa polyklonální protilátky, která je zakotvená na
stěnách jamek (60 min, laboratorní teplota, tma). Po imunoreakci jsou jamky
promyty 6x a přidá se tetrametylbenzidin a vývoj barevné reakce (30 min,
laboratorní teplota, tma) se zastaví stop činidlem. Měření probíhá při 450/650
nm do 1 h. Intenzita zbarvení je nepřímo úměrná koncentraci morfinu ve vzorku.
Analytická citlivost metody je 3,5 nmol/l. Rozsah měření do 87,6 nmol/l.
Specifita protilátky umožňuje se vyhnout extrakci před imunoreakcí. Přesnost
v sérii je 9,43 – 12,83 %. Křížová reakce: kodein 3,3 %,
morfin-3-glukuronid 2,5 %, ostatní ≤ 2 %.
FPIA (fluorescenční polarizační imunoanalýza) je kompetitivní homogenní
postup. Vzorek zředěný fosfátovým pufrem se nechá reagovat s bílkovinným
stabilizátorem a ovčí protilátkou vůči opiátům a indikátorem opiátů značeným
fluoresceinem, který soutěží o vazebná místa protilátky. Polarizované světlo ze značeného imunokomplexu,
který je velký a rotuje pomalu, bude mnohem větší, než z rychle rotujícího
malého konjugátu. Intenzita fluorescence (excitace 485 nm, emise 525 –
550 nm) je nepřímo úměrná koncentraci opiátů ve vzorku. Na základě šestibodové
kalibrace je rozsah metody 175 – 3505 nmol/l. Automatické ředění 3x umožňuje
měřit koncentrace do 6300 nmol/l, vyšší koncentrace lze ředit manuálně. Při
nastavení cut-off lze automaticky hodnotit výsledky jako pozitivní či
negativní. Preciznost v sérii 3,13 -6,99 %, celkem 3,70 – 8,11 %; zpětný
výtěžek 92,76 – 102,74 %. Při stanovení interferují deriváty morfinu, kodein a
dihydrokodein. Neruší ikterus a hemolýza do 1,15 g hemoglobinu/l.
FRAT (free radical-labeled assay technique) je homogenní kompetitivní
postup, který měří elektronovou spinovou rezonancí spin stabilního radikálu
oxidu dusného, použitého jako marker drogy. Měří se energie absorbovaná
nepárovými elektrony při přechodu ze základního do excitovaného stavu. Spektrum
je špičaté, pokud je značená droga volná, a široké a ploché, když se značená
droga váže na protilátku. Tedy čím více bude při kompetici o protilátku opiátu
ve vzorku, tím bude amplituda spektra vyšší. Komerční soupravy vyžadovaly
poměrně náročné detekční zařízení.
GC-MS začíná kyselou hydrolýzou s následnou extrakcí za přítomnosti
pevného absorbentu. Po promytí kolony se morfin eluuje metanolem a eluát se
odpaří. Na odparek se nechá působit N-metyl-N-(trimetylsilyl)trifluoracetamidem,
aby se získal trimetylsilylderivát opiátů, který je analyzován GC/MS
s využitím deuterovaných (D3) derivátů morfinu a kodeinu jako
vnitřních standardů. Citlivost metody je 1,75 nmol/l, preciznost 6,9 %.
V případě použití samotné plynové chromatografie (po extrakci etylacetátem
a derivatizaci trimetylsilylimidazolem) s detektorem elektronového záchytu
je citlivost 0,35 nmol/l a preciznost 2 %.
HPLC-MS také využívá extrakce a separace (kolona C18 s vodným
roztokem acetonitrilu) s následnou oxidací ferrikyanidem draselným na
fluoreskující dimer, který se stanovuje při 254 nm fluorescenčním detektorem
(mez detekce 14 nmol/l, preciznost 6 %), nebo se dále vede do MS, kde se
stanovuje (mez detekce 35 nmol/l, preciznost 6,9 %).
Moderní technologie využívá hmotnostní spektrometr s trojitým
kvadrupólem a v tomto případě pro chromatografické dělení se používá
gradientová chromatografie (voda-acetonitril, 50 °C) na 5 cm koloně ZORBAX C18,
kde dochází k rozdělení za 3,5 min. Celý cyklus, včetně detekce kationtů
po elektrospreji, trvá 8 min. Detekční limit pro morfin je 3,5 nmol/l.
Referenčním standardem je morfinsulfát (čistota 99,9 %) a
morfin-3β-D-glukuronid (čistota 99,5 %).
Interference
Droga snižuje hladiny v séru: enteroglukagon, gastrický inhibiční
polypeptid, inzulin, kortizol, kyselina mléčná (o 50 %), motilin, noradrenalin,
pankreatický polypeptid
Droga snižuje hladiny v moči: alkaloidy, 17-hydroxykortikosteroidy,
17-ketosteroidy, objem moče, vanilmandlová kyselina
Droga zvyšuje hladiny v séru: adrenalin, antidiuretický hormon, ALP,
ALT, amoniak, AMS, AST, bilirubin, bromsulfaleinový test, CK, glukóza, gastrin,
glykovaný hemoglobin, histamin, hydrogenkarbonát, LD, lipáza, pCO2,
prolaktin, TSH
Droga zvyšuje hladiny v moči: glukóza, AMS
Droga zvyšuje hladiny v likvoru: bílkoviny
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28