Stanovení neopterinu
Synonyma
D-neopterin,
D-erythroneopterin, 6-D-erythroneopterin;
D-erythro-6-trihydroxypropylpterin,
6-(D-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)pterin,
[S-(R*,S*)]-2-amino-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)-1H-pteridin-4-on;
neopterine,
[S-(R*,S*)]-2-amino-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)-1H-pteridin-4-one,
[S-(R*,S*)]-2-amino-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)-1H-pteridine-4-one
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v moči z 12h nebo 24h sběru
nebo se používá první ranní moč. Moč nutno chránit před světlem ihned po
odběru. Stabilita analytu v moči je 1 d při 20 – 25 °C, 5 d při 4 – 8 °C,
60 měsíců při -20 °C (zamrazený vzorek skladovat v alobalu).
Stanovení lze také provádět v séru, plazmě
(antikoagulans EDTA) a likvoru. Také tyto biologické materiály (včetně původní
krve) nutno uchovávat ve tmě. Stabilita analytu v séru je 3 d při 20 – 25
°C, 7 d při 4 – 8 °C, > 6 měsíců při -20 °C (zamrazený vzorek skladovat
v alobalu), při -70 °C 1 rok.
Poznámky k analytické
metodě
RIA je kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory
jsou protřepány s 125I-neopterinem a se specifickou protilátkou
ve zkumavkách a pak inkubovány 1 h při laboratorní teplotě ve tmě. Přidá se
promývací roztok a zkumavky třepou 10 min a centrifugují. Obsah zkumavek
dekantuje a měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo
úměrný koncentraci neopterinu ve vzorku. Rozsah měření na základě sedmibodové
kalibrace 3 – 729 nmol/l. Analytická citlivost je 0,8 nmol/l.
ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní
postup, který používá zakotvenou kozí protilátku vůči králičímu IgG a do jamek
se přidává vzorek (moč se ředí 100x) nebo kalibrátor, neopterin značený POD a
králičí protilátka proti neopterinu (polyklonální
protilátka vůči neopterinu může také být zakotvená přímo v jamkách).
Po inkubaci (90 min ve tmě, některé
soupravy 2 h) a promytí 4x se přidá tetrametylbenzidin v pufru. Roztok
se inkubuje 10 min (30 min) ve tmě,
pak se pipetuje stop činidlo (1 M H2SO4). Absorbance při
450 nm se měří do 15 min a je nepřímo úměrná koncentraci neopterinu ve
vzorku. Celý postup probíhá za
laboratorní teploty. Na základě šestibodové (osmibodové) kalibrace je rozsah metody 0,7 – 111 (100) nmol/l. Analytická citlivost 0,7
nmol/l. Preciznost v sérii je 4,3 – 11,7 %, mezi sériemi 8,8 – 13,8 %;
linearita ředění 87 – 120 %, zpětný výtěžek 81 – 116 %. Hemolýza, chylozita ani
ikterus stanovení neruší. Křížová reaktivita 7,8-dihydroneopterin 2 %, ostatní
< 0,44 %.
HPLC-MS/MS se používá ke stanovení v plazmě. Na
koloně C18 se používá gradient voda-metanol (s příměsí 0,002 % HCOOH) od 100:0
po 5:95. Tandemová MS používá kvadrupólový hmotnostní spektrometr s
elektrosprejí -4300 V při 400 °C; původní ion m/z 265, produkt iontové
přeměny m/z 192. Kalibrační křivka je lineární od 0,4 do 197 nmol/l. Preciznost
v sérii i mezi sériemi je < 15 %.
Interference
Výsledky snižuje: působení světla, kouření, psychologický
stres.
Výsledky zvyšuje v séru: alkoholismus, vysoký věk,
transplantace srdce, TNF-α.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28