Stanovení neuron specifické enolázy (NSE)

Synonyma

systematický název (EC 4.2.1.11): 2-fosfo-D-glyceráthydrolyáza, 2-phospho-D-glycerate hydro-lyase

akceptovaný název IUPAC: phosphopyruvate hydratase tedy fosfopyruváthydratáza

další názvy: enolase, enolase 2, ENO2, gamma-enolase, γ-enolase, nervous-system specific enolase, neuronal-specific enolase, 2-phosphoglycerate enolase; 2-phosphoglycerate dehydratase, 2-phosphoglyceric dehydratase, phosphoenolpyruvate hydratase;14-3-2-protein

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Prof. Kodíček uvádí celý název jako jedno slovo, v anglickém názvosloví EC je kmenový základ (např. hydratase) vždy samostatně.

Preanalytická fáze

Stanovení se provádí přednostně v séru (separaci zajistit do 1 h), popřípadě v plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin). Je třeba vyloučit i slabou hemolýzu (uvolnění NSE z erytrocytů je podstatné již při koncentraci Hb > 50 mg/l), uvolnění NSE z trombocytů nebo chylozitu. Stabilita NSE v séru nebo plazmě 2 – 3 d při 15 -25 °C, 1 – 3 d při 4 – 8 °C, 12 týdnů při -20 °C. Opakované zamrazení vzorku se nedoporučuje.

Poznámky k analytické metodě

IRMA používá protilátku vůči NSE vázanou na pevnou fázi, na kterou se váže NSE ze vzorku a pak na něj druhá protilátka vůči NSE značená ¹²⁵I. V soupravě jsou použity myší monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům molekuly NSE. Imunoreakce sendvičového typu probíhá v jednom kroku. Stanovení se provádí za laboratorní teploty. Nejprve se ve zkumavkách potažených první monoklonální protilátkou inkubují vzorky nebo kalibrátory a následně druhá protilátka značená ¹²⁵I. Po inkubaci (2 h, třepání) se odsaje obsah zkumavek a 2x se vymyje nenavázaná značená protilátka. Vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace NSE v kalibrátorech a vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení šesti sérových kalibrátorů a hodnoty NSE přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Rozsah stanovení je 0,29 – 200 µg/l. Analytická citlivost je 0,29 µg/l, funkční citlivost je 0,52 µg/l. Preciznost v sérii ≤ 7,6 %, mezi sériemi ≤ 7,3 %. Linearita ředění je 83 – 107 %, zpětný výtěžek 81 – 117 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 20000 µg/l. Nepoužívejte hemolytické, lipemické ani ikterické vzorky. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

ELISA používá dvou protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou a druhá má biotinylovou kotvu. Mikrotitrační jamky jsou potaženy streptavidinem (v některých soupravách je monoklonální protilátka zakotvena přímo v jamkách). Po inkubaci 1 h za stálého třepání a pětinásobném (nebo 3x) propláchnutí se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 10 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (0,5 M H₂SO₄) a měří se při 450 nm do 10 min (lze i bichromaticky s druhou vlnovou délkou: 595, 620 nebo 630 nm), kdy absorbance je přímo úměrná koncentraci NSE. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Čtyřbodová (pětibodová) kalibrace umožňuje měření v intervalu 5 – 178 (nebo jen 100) µg/l. Ruší i slabá hemolýza. Detekční limit je 1,2 µg/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 µg/l. Preciznost v sérii je 3,5 – 4,0 %, mezi sériemi 4,85 – 5,99 %. Linearita ředění 96 – 102 %, zpětný výtěžek 96 – 117 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Inkubace trvá 59 min. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k NSE) přímo úměrný hladině NSE. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,8 – 200 µg/l (po automatickém ředění až do 10000 µg/l). Analytická citlivost je 0,8 µg/l, funkční citlivost < 1,0 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10000 µg/l. Preciznost v sérii 1,5 – 9,5 %, mezi sériemi 2,9 – 15,3 %. Hemoglobin neruší do 8 g/l (ale i slabá hemolýza falešně zvyšuje výsledky!), triacylglyceroly do 9 mmol/l, bilirubin nevadí. Linearita ředění je 90 – 110 %.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Mikrotitrační destičky jsou potaženy směsí protilátek vůči NSE. Po pipetování vzorku se přidají protilátky vůči NSE značené Eu³⁺. Po inkubaci (1 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí, pak se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu³⁺ emise 613 nm) je přímo úměrná koncentraci analytů ve vzorku a měří se do 1 h. Detekční limit 1 µg/l. Preciznost v sérii 3,0 – 3,4 %, mezi sériemi 2,4 – 5,6 %, celková 3,7 – 6,6 %. V soupravě neinterferuje enoláza z erytrocytů ani při velké hemolýze.

CLIA je jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže NSE a současně se na jeho další epitop připojí druhá myší monoklonální protilátka značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 10 minut, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině NSE. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0,04 – 200 µg/l. Detekční limit < 0,04 µg/l. Efekt nadbytku antigenu do 1500 µg/l nebyl pozorován. Preciznost v sérii 0,9 – 2,7 %, mezi sériemi 3,7 – 5,9 %. Linearita ředění je 89 – 97 %, zpětný výtěžek 95 – 103 %. Hemolýza ruší, lipémie a ikterus nevadí. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči NSE a monoklonální myší protilátkou vůči NSE značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Monoklonální protilátky 18E5 a 84B10 jsou směřovány vůči gama-podjednotce NSE. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci NSE ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,05 – 370 µg/l (ředění 2x automaticky, pak měření do 740 µg/l, ale koncentrace ředěného vzorku musí být > 50 µg/l). Analytická citlivost je 0,05 µg/l, funkční citlivost je 0,25 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 100000 µg/l. Preciznost v sérii CV 0,6 – 3,1 %, mezi sériemi 1,6 – 4,4 %. Chylozita, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Vadí i slabá hemolýza. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Toleranční limit EHK: 22 %.

Interference

Zvýšené hodnoty jsou, kromě u celé řady karcinomů, také u urémie, benigních chorob plic, chorob mozku, úrazů hlavy, křečových stavů, u těhotných s defektem neurální trubice a v dalších případech.

Další informace

Principy analytických postupů

Petr Štern, 2014-01-28