Stanovení osteokalcinu
Synonyma
osteocalcin, BGLAP (bone gamma-carboxyglutamate protein,
Bglap1, Bglap2, BGP, Bgpr, Bgpra, Bone Gla-protein, GLA, mOC-A, OC, OCN, OG1,
RP11-54H19.5, PMF1
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v plazmě (heparinát sodný) nebo
v séru. Při odběru vzorku je třeba zabránit hemolýze. Odběrovou nádobku ihned umístit do ledové lázně a urychleně
transportovat do laboratoře. Zde okamžitě centrifugovat v chlazené centrifuze.
Doporučen přídavek aprotininu. Nejlépe odběr nalačno mezi 8. a 9. h.
Maximální čas od získání do
zpracování vzorku plazmy je 2 h při doporučené teplotě 4°C. Stabilita
v plazmě při 20 – 25 °C 5 min, při 4 – 8 °C 2 h, při -20 °C 30 dnů.
V séru při 20 – 25 °C 4 h (přídavkem aprotininu lze prodloužit na 8 h),
při 4 – 8 °C 24 h, při -20 °C 1 rok.
Osteokalcin je možné měřit i v moči, kultivačních
buňkách nebo kultivačním supernatantu.
Poznámky k analytické
metodě
RIA kompetitivní metoda vychází z toho, že
standard, resp. vzorek osteokalcinu soutěží o volná místa na směsi protilátek
vůči osteokalcinu značených 125I nebo neznačených. Po inkubaci 2,5 h
při 37 °C se přidá druhá protilátka a precipitační činidlo. Inkubuje se 10 min
za laboratorní teploty, pak se sraženina centrifuguje a po dekantaci (nebo
odstátí) se měří gama-počítačem. Metoda dovoluje měřit koncentrace 1 – 50 µg/l.
Preciznost v sérii je 6 %, mezi sériemi 9 %.
IRMA postupy mají první protilátku vůči osteokalcinu
vázanou na zkumavku nebo kuličku. Druhá protilátka je značená 125I.
Imunoreakce trvá alespoň 2 h za laboratorní teploty. Metody dovolují měření
v intervalu 4,7 – 160, resp. 5,5 – 280, resp. 0,6 – 61 µg/l. Preciznost
v sérii je 1,4 – 10,6 %, mezi sériemi 2,1 – 6,1 %. Detekční limit je od
0,04 (po inkubaci 18 h!) do 1,2 µg/l.
ELISA
v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou
protilátkou vůči osteokalcinu. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a poté
druhá protilátka vůči osteokalcinu s křenovou peroxidázou. Po
inkubaci 2 h a promytí 3x se přidá chromogen dimetylbenzidin a reakce
probíhající ve tmě je zastavena po 30 min stop činidlem (1 M HCl). Měření při
450 nm nutno provést do 1 h. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty.
Kalibrace je šestibodová. Detekční limit je 0,8 µg/l, zpětný výtěžek 97 – 111
%, linearita ředění 77,7 – 100 %, interval měření 0,8 – 75 mg/l. Efekt nadbytku
antigenu se neprojevuje do 625 µg/l. Preciznost v sérii 3,1 – 4,7 %, mezi
sériemi 3,5 – 5,6 %. Silná hemolýza a lipémie stanovení ruší.
Rychlejší
varianta používá mikrotitrační destičku s jamkami potaženými
streptavidinem. Po přidání standardu nebo vzorku se přidá směs biotinylované
protilátky vůči osteokalcinu a monoklonální protilátky vůči osteokalcinu
s POD značkou. Po inkubaci 1 h a pětinásobném propláchnutí se přidá
substrát dimetylbenzidin a inkubuje se 20 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo
(ředěná H2SO4) a měří se do 10 min při 450 nm (lze i
bichromaticky proti 595, 620, 630 nm). Celý postup se realizuje za laboratorní
teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,31 – 64 µg/l
se zpětným výtěžkem 89 – 102 %. Linearita ředění je 87 – 101 %. Preciznost
v sérii 4,7 – 5,0 %, mezi sériemi 5,7 – 8,3 %. Efekt nadbytku antigenu se
neprojevuje do 1250 µg/l. Zbytky polyesterové pryskyřice snižují aktivitu
křenové peroxidázy.
Při jiném ELISA
postupu se v mikrotitračních destičkách zakotví myší monoklonální
protilátka proti osteokalcinu až během analýzy a to až po pipetování standardu
nebo vzorku. Po inkubaci 2 h a trojnásobném promytí se přidá kozí protilátka
vůči myšímu IgG značená ALP. Po inkubaci 1 h a trojnásobném promytí se přidá
substrát (p-nitrofenylfosfát), inkubuje se 35 – 40 min a přidá se stop
činidlo (0,5 M NaOH). Měření se provádí při 405 nm do 15 min podle šestibodové
kalibrační křivky. Detekční limit je 0,45 µg/l. Preciznost v sérii 4,8 –
10 %, mezi sériemi 4,8 – 9,8 %. Vzorky s koncentrací > 32 µg/l nutno
ředit 2x. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je
označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu,
pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho
životnosti. Inkubace trvá 14 min. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci
(připojení obou značených monoklonálních protilátek k osteokalcinu) přímo
úměrný hladině osteokalcinu. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření
0,4 – 270 µg/l (po automatickém ředění až do 2700 µg/l). Analytická citlivost
je 0,4 µg/l, funkční citlivost 1,4 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje
do 550 µg/l. Preciznost v sérii 0,7 – 2,9 %, mezi sériemi 0,7 – 6,5 %.
Hemoglobin 2,5 g/l vede k výrazně nižším výsledkům (hemolytické vzorky
nelze měřit!); triacylglyceroly do 5,6 mmol/l a bilirubin nevadí. Linearita
ředění je 70 – 110 %.
CLIA
je dvoustupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší
monoklonální protilátkou se naváže osteokalcin (inkubace 10 min). Pak se na
jeho další epitop připojí druhá myší monoklonální protilátka značená
izoluminolem. Imunoreakce probíhá 20 minut; po promytí se přidá startér (0,12 %
H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk.
Intenzita signálu je přímo úměrná hladině osteokalcinu. Rozsah měření na
základě dvoubodové kalibrace je 0,5 – 300 µg/l (vyšší koncentrace osteokalcinu
se ředí 10x). Analytická citlivost je ≤
0,5 µg/l, funkční citlivost 3,0 µg/l. Efekt nadbytku antigenu do 1500 µg/l
nebyl pozorován. Preciznost v sérii 3 – 8 %, mezi sériemi 4 – 9 %; zpětný výtěžek 84 – 115 %. Hemolýza ruší, lipémie a ikterus
nevadí.
Chemiluminiscenční
analýza je jednostupňová imunoreakce sendvičového typu, kdy se přidává k
polystyrenové kuličce s kotvící myší monoklonální protilátkou vůči
osteokalcinu stanovovaná bílkovina a následně roztok polyklonální králičí
protilátky vůči osteokalcinu značené ALP (z telecího střeva) v pufru. Po 30
minutové inkubaci při 37 °C se nenavázaná druhá protilátka odstraní promytím
při centrifugaci. Přidá se substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který
hydrolyzuje stykem s ALP za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned
rozpadá za produkce záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého
záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci osteokalcinu ve vyšetřovaném
vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové
křivky získané z čárového kódu činidla. Interval měření je 2 – 100 µg/l,
analytická citlivost (limit blanku) 0,19 µg/l, mez detekce 0,45 µg/l, funkční
citlivost (CV ≤ 20 %) 0,81 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 60300 µg/l. Přítomnost
bilirubinu do 171 µmol/l, hemoglobinu do 1,5 g/l a triacylglycerolů do 33,9
mmol/l stanovení neruší. Preciznost metody v sérii 2,5 – 4,8 %, celková
7,0 – 10,4 %. Zpětný výtěžek stanovení 83 – 100 %, linearita ředění 103 – 130
%. Heterofilní
protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny
obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
Stanovení
elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém
uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s biotinylovanou
monoklonální protilátkou proti N-MID fragmentu osteokalcinu (aminokyseliny 1 –
43) a monoklonální protilátkou proti N-MID fragmentu osteokalcinu značenou
ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají
biotinylované paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý
komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční
směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na
povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového
činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří
fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky,
která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a
vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná
koncentraci osteokalcinu ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,5 – 300
nmol/l. Vyšší koncentrace se ředí 5x. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je
0,5 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 4,1 %, mezi sériemi 6,6 %. Od pacientů
léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat
vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. U pacientů, kteří byli
léčeni monoklonálními myšími protilátkami, nebo dostali protilátky k
diagnostickým účelům, se projevila interference v důsledku extrémně
vysokého titru těchto protilátek vůči streptavidinu.
Toleranční
limit EHK: 17 %.
Interference
Výsledky snižují: hemolýza (degradace erytrocytární
proteázou), maraton, těhotenství (1. a 2. trimestr), EDTA, citronát, heparinát
lithný, oxalát, bilirubin, opakované rozmrazení, alkoholismus, antagonisté
vitaminu K, glukokortikoidy, kortikosteroidy, thiazidy, warfarin.
Výsledky zvyšují: puberta, kalcitriol, těhotenství (3.
trimestr), menopauza, hojení fraktur, transplantace ledviny, cvičení (až o 50
%), laktace, fosfáty, fluoridy.
Další lékové interference: kumarinová antikoagulancia,
estrogeny, kalcitonin, perorální kontraceptiva, tamoxifen.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28