Stanovení oxidovaného
LDL-cholesterolu
Synonyma
OxLDL, oxidized LDL
Preanalytická fáze
Pro analýzu lze použít plazmu s EDTA nebo heparinem. Plazma
nebo sérum se musí odstředit před aplikaci precipitačního činidla.
Poznámky k analytické
metodě
Při oxidaci nenasycených mastných kyselin s více dvojnými
vazbami vznikají reaktivní aldehydy malondialdehyd (MDA) a 4-hydroxynonenal
(HNE), které se váží na lysinové zbytky ApoB-100 a vznikají adukty MDA-LDL a
HNE-LDL. Také vznikají konečné produkty pokročilé glykosylace CML-LDL
(N-karboxymetyllysin) a CEL-LDL (N-karboxyetyllysin), tedy celkem 4 druhy
oxidovaného LDL-cholesterolu. K dispozici jsou tři specializované ELISA
soupravy, ale také ELISA pro sumární oxidovaný LDL-cholesterol.
ELISA stanovení CML-LDL se provádí v dubletu za
laboratorní teploty v mikrotitračních destičkách a souprava obsahuje
standard LDL-cholesterolu oxidovaného měďnatými ionty. Mez detekce metody je
150 µg/l. Stanovení lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických
tekutinách. V biologickém materiálu se vysráží LDL, postup se zopakuje a
následuje centrifugace a dekantace. LDL se rozpustí ve fosfátovém pufru a
pipetuje se do jamky potažené kotvící protilátkou vůči CML-LDL (inkubace 1 h).
Po trojnásobném promytí se přidá ředěné blokační činidlo (třepání 1 h) a jamky
se 5x promyjí. Přidá se ředěná kozí polyklonální protilátka vůči ApoB100
s biotinylovou koncovkou (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Následně se
přidá enzym se streptavidinovým můstkem, který se na ni zachytí (třepání 1 h) a
jamky se 5x promyjí. Po přidání teplého substrátu (třepání 5 – 20 min) a
zastavení barevné reakce stop činidlem se ihned provádí fotometrické měření při
450 nm. Kalibrace je osmibodová. Naměřená absorbance je přímo úměrná
koncentraci CML-LDL.
ELISA stanovení HNE-LDL se provádí v dubletu za
laboratorní teploty v mikrotitračních destičkách a souprava obsahuje
standard LDL-cholesterolu oxidovaného měďnatými ionty. Mez detekce metody je
150 µg/l. Stanovení lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických
tekutinách. V biologickém materiálu se vysráží LDL, postup se zopakuje a
následuje centrifugace a dekantace. LDL se rozpustí ve fosfátovém pufru a
pipetuje se do jamky potažené kotvící protilátkou vůči HNE-LDL (inkubace 1 h).
Po trojnásobném promytí se přidá ředěné blokační činidlo (třepání 1 h) a jamky
se 5x promyjí. Přidá se ředěná kozí polyklonální protilátka vůči ApoB100
s biotinylovou koncovkou (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Následně se
přidá enzym se streptavidinovým můstkem, který se na ni zachytí (třepání 1 h) a
jamky se 5x promyjí. Po přidání teplého substrátu (třepání 5 – 20 min) a
zastavení barevné reakce stop činidlem se ihned provádí fotometrické měření při
450 nm. Kalibrace je osmibodová. Naměřená absorbance je přímo úměrná
koncentraci HNE-LDL.
ELISA stanovení MDA-LDL se provádí v dubletu za
laboratorní teploty v mikrotitračních destičkách a souprava obsahuje
standard LDL-cholesterolu oxidovaného měďnatými ionty. Mez detekce metody je
< 50 µg/l. Stanovení lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických
tekutinách. V biologickém materiálu se vysráží LDL, postup se zopakuje a
následuje centrifugace a dekantace. LDL se rozpustí ve fosfátovém pufru a
pipetuje se do jamky potažené kotvící protilátkou vůči MDA-LDL (inkubace 1 h).
Po trojnásobném promytí se přidá ředěné blokační činidlo (třepání 1 h) a jamky
se 5x promyjí. Přidá se ředěná kozí polyklonální protilátka vůči ApoB100
s biotinylovou koncovkou (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Následně se
přidá enzym se streptavidinovým můstkem, který se na ni zachytí (třepání 1 h) a
jamky se 5x promyjí. Po přidání teplého substrátu (třepání 5 – 20 min) a
zastavení barevné reakce stop činidlem se ihned provádí fotometrické měření při
450 nm. Kalibrace je osmibodová. Naměřená absorbance je přímo úměrná
koncentraci MDA-LDL.
ELISA stanovení sumárního oxidovaného LDL-cholesterolu
lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických tekutinách. Standard
nebo vzorek se pipetuje do jamky potažené kotvící protilátkou vůči oxidovanému
LDL-cholesterolu (inkubace 2 h při 37 °C). Přidá se ředěná protilátka vůči
oxidovanému LDL-cholesterolu s biotinylovou koncovkou (inkubace 1 h) a
jamky se 3x promyjí. Následně se přidá enzym s avidinovým můstkem, který se na
ni zachytí (inkubace 30 min) a jamky se 5x promyjí. Po přidání substrátu
tetrametylbenzidinu (inkubace 15 – 25 min) a zastavení barevné reakce stop
činidlem (ředěná H2SO4) se ihned provádí fotometrické
měření při 450±10 nm. Šestibodová
kalibrace umožňuje měření v intervalu 31 – 2000 ng/l, mez detekce metody
je 1,25 ng/l. Preciznost v sérii je 10 %, mezi sériemi 12 %, zpětný
výtěžek v plazmě 78 – 103 %, v séru 89 – 97 %. Linearita ředění
v plazmě 78 – 104 %, v séru 85 – 103 %.
Interference
Žádné interference nejsou v literatuře uvedené.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28