Stanovení parathormonu
Synonyma
Parathyrodní hormon, PTH, i-PTH, parathyrin, intaktní parathyrin
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v plazmě nebo séru. Odběr provádět do
vychlazené zkumavky, transport do laboratoře v ledové lázni (lze také
odstředit v chlazené centrifuze a dopravovat zmrazenou plazmu). Opakované
zmrazování a rozmrazování strukturu hormonu poškozuje. K separaci séra
nebo plazmy použít chlazenou centrifugu a udržovat teplotu do 8 °C. Vzorky
nelze stabilizovat azidem sodným. Stabilita v plazmě nebo séru při 2 – 8
°C 2 dny, při -20 °C 25 týdnů.
Poznámky k
analytické metodě
Kompetitivní RIA postup nebyl dostatečně citlivý a specifický. Mnohem
úspěšnější jsou sendvičové postupy s různými markery. Obvykle se používá
protilátka vůči PTH (sekvence 39-84, 44-84 nebo 74-84) zakotvená (kovalentně
nebo nekovalentně) na pevné fázi. Druhá protilátka vůči PTH (sekvence 1-34) se
značkou může být přidávaná současně se vzorkem. Stanovení intaktního PTH je
diagnosticky důležitější, protože je na rozdíl od fragmentů biologicky aktivní.
IRMA sendvičového typu používá dvě protilátky vůči různým epitopům PTH.
Zkumavka je potažena kotvící polyklonální protilátkou vůči PTH, pak se přidá
standard nebo vzorek. Po inkubaci a odsátí se přidá monoklonální protilátka
značená 125I. Po další inkubaci, odsátí a dvojnásobném promytí se
měří signál gama-počítačem. Rozsah měření po šestibodové kalibraci je do 274
pmol/l. Analytická citlivost je 0,2 pmol/l. Preciznost v sérii je ≤
7,7 %, mezi sériemi ≤ 10,3 %. Linearita ředění je 98 – 121 %, zpětný
výtěžek 91 -110 %. Rozsah měření je 0,2 – 263 pmol/l. Heterofilní protilátky v
lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými
v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
ELISA
v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou
polyklonální kozí protilátkou vůči fragmentu 1-34 PTH. Do jamky se přidá
standard nebo vzorek a po inkubaci a promytí myší monoklonální protilátka vůči
fragmentu 44-68 PTH s navázanou křenovou peroxidázou. Po další inkubaci
a promytí se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající ve tmě je
zastavena stop činidlem. Měření při 450 nm nutno provést do 1 h. Celý postup se
realizuje za laboratorní teploty. Citlivost metody je 0,21 pmol/l.
Jiná ELISA používá dvou polyklonálních kozích
protilátek vůči fragmentům 1-34 (tato Ab je značená křenovou peroxidázou) a
39-84 (tato Ab má biotinylovou kotvu) PTH. Mikrotitrační jamky jsou potaženy
streptavidinem. Po inkubaci 3 h a pětinásobném propláchnutí se přidá substrát tetrametylbenzidin
a inkubuje se 30 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (2M H2SO4)
a měří se do 10 min bichromaticky při 450/405 nm. Celý postup se realizuje za
laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu
0,16 – 74 pmol/l se zpětným výtěžkem 95 – 109 %. Linearita ředění je 84 – 109
%. Preciznost v sérii 3,7 – 6,1 %, mezi sériemi 2,8 – 3,6 %. Efekt
nadbytku antigenu se neprojevuje do 221 nmol/l. Zbytky polyesterové pryskyřice
snižují aktivitu křenové peroxidázy.
Chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá kozí
polyklonální protilátku vůči intaktnímu PTH, zakotvenou na paramagnetických
částicích ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a
promytí fosfátovým pufrem se přidá kozí polyklonální protilátka vůči PTH
značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá
1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá
chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci i-PTH a sleduje se fotonásobičem
při 429 nm. Metoda dovoluje
měřit vzorky v rozmezí koncentrací 0,32 – 316 pmol/l (vyšší koncentrace se
ředí 2x). Preciznost v sérii 2,9 – 6,1 %, celkově 3,0 – 6,4 %. Zpětný
výtěžek je 101 %, linearita 97 – 103 %. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %)
je 0,32 pmol/l, analytická senzitivita (nulový blank) 0,024 pmol/l. Ani vysoké
koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Podobný princip
zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou.
První protilátka je polyklonální kozí vůči lidskému
PTH (N-terminální 1-34) značená esterem akridinu. Druhá protilátka je
biotinylovaná polyklonální kozí vůči PTH (39-84 oblast). Obě protilátky se
pipetují současně bezprostředně po vzorku a pak se 6 min roztok inkubuje.
Přidají se paramagnetické latexové částice (streptavidin je kovalentně na ně
vázáný) a opět se inkubuje 3 min. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá
peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Vzorky s koncentrací PTH > 200 pmol/l se
ředí 5x. Analytická citlivost je 0,265 pmol/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do
10,6 nmol/l. Preciznost v sérii 1,4 – 4,3 %, mezi sériemi 1,9 – 7,3 %.
Linearita ředění je 88,9 – 105,8 %, zpětný výtěžek 91,0 – 123,6 %. Heterofilní
protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny
obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
CLIA je dvoustupňové sendvičové stanovení. Vzorek se
inkubuje 10 min s reakčním pufrem a polyklonální protilátkou konjugovanou s
izoluminolem s vysokou afinitou vůči části 1-34 molekuly 1-84 PTH. Po inkubaci
jsou do reakce přidány paramagnetické částice potažené druhou monoklonální
protilátkou, která má tendenci se vázat na C-terminální část (39-84) molekuly
1-84 PTH a inkubují se 10 min. Po promytí je přidán startér (0,12 % H2O2 +
4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná
hladině PTH. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0,4 – 212 nmol/l.
Analytická citlivost je 0,21 nmol/l, funkční
citlivost 0,42 nmol/l. Efekt nadbytku antigenu do 26500 nmol/l nebyl pozorován.
Preciznost v sérii 2,3 – 8,0 %, mezi sériemi 3,4 – 13,7 %; zpětný
výtěžek 89 – 108 %. Hemolýza, lipémie a ikterus ruší.
Jiné stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci. PTH se v
prostředí pufrovaného roztoku váže jedním epitopem na polyklonální kozí
protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 minut při
37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý
epitop PTH s polyklonální kozí protilátkou konjugovanou s alkalickou
fosfatázou. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje
luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je přímo úměrná
koncentraci celého PTH ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle
kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě
dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového
kódu činidla. Vzorky s koncentrací PTH vyšší než 263 pmol/l se ředí 10x.
Funkční citlivost (CV £ 20 %) je 0,1
pmol/l. Preciznost v sérii (227,4 pmol/l) < 7,1 %, v čase (28,7
pmol/l) < 5,6 %, zpětný výtěžek 92 -110 %. Efekt nadbytku antigenu se
neprojevuje do 105,3 nmol/l. Fragment PTH 7-84 vykazuje křížovou reaktivitu
přibližně 80 %. Hemolýza a bilirubin zapříčiňují snížení naměřených hodnot.
Rovněž ruší lipémie.
Jiný postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky
se pipetuje monoklonální protilátka vůči intaktnímu PTH značená ALP a standard
nebo vzorek. Pak se přidají paramagnetické částice potažené kozí polyklonální
protilátkou vůči PTH. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím
odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Rozsah
měření při 470 nm je 0,1 – 371 pmol/l (po ředění 3174 pmol/l). Analytická citlivost
0,1 pmol/l. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,4 pmol/l. Efekt nadbytku
antigenu se neprojevuje do 26,5 nmol/l. Linearita ředění je 73 – 105 %.
Preciznost v sérii 1,6 – 2,6 %, mezi sériemi 2,8 – 5,8 %.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován
s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči PTH a monoklonální
myší protilátkou vůči PTH značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové
formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a
celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy.
Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí
magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí
tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci parathormonu ve vzorku.
Hemoglobin > 1,5 g/l ovlivňuje stanovení, chylozita, ikterus a RF (< 1500
kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5
mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání
biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,127 – 530 pmol/l. Vyšší koncentrace
se ředí 5x. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,64 pmol/l.
Reprodukovatelnost v sérii CV 1,1 – 2,7 %, mezi sériemi 2,8 – 6,5 %. Efekt
nadbytku antigenu se neprojevuje do 1802 pmol/l. Ruší velmi vysoké hodnoty
protilátek vůči streptavidinu a rutheniu.
Toleranční limit EHK: 23 %.
Interference
Výsledky snižuje: zvýšená koncentrace EDTA (u metod s ALP značkou),
orální zátěž vápníkem, léčba kalcimimetiky, katecholaminy, imobilizace,
alkoholismus, vitamin D3, hemodialýza, ketokyseliny, velký úbytek
hmotnosti.
Výsledky zvyšuje: tělesná zátěž (až o 90 %), termální trauma, lithium
(až o 50 %), furosemid, hemolýza, chylozita, selhání ledvin, léčba kalcilytiky,
příjem vysokých dávek fosfátů (až o 125 %) a nedostatek vápníku, dopamin,
vegetariánská dieta, heterofilní protilátky.
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28