Stanovení
progesteronu
Synonyma
Systematický název: pregn-4-en-3,20-dion, pregn-4-ene-3,20-dione, 4-pregnene-3,20-dione
progestin,
progestogen, progesterol, crinone, endometrin, lipo-lutin
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA
nebo heparin), případně ve slinách nebo moči. Nesmí být použity vzorky
stabilizované azidem. Stabilita analytu 1 d při 20 – 25 °C (pokles za 168 h o
10 %), 5 – 14 d při 4 – 8 °C, 25 týdnů při -20 °C. Opakované zamrazení se
nedoporučuje. Sérum lze zasílat poštou bez chlazení (do 24 h). Suchá kapka je
stabilní při 25 °C 15 týdnů, při 37 °C 9 týdnů. Sliny jsou stabilní 5 dnů při
pokojové teplotě, 10 d při 2 – 8 °C a dlouhodobě při -20 °C.
U fertilních žen závisí koncentraci na fázi menstruačního
cyklu. Je vhodné uvést den cyklu.
Poznámky k analytické
metodě
RIA je kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory
jsou inkubovány 3 h za stálého třepání při laboratorní teplotě (nebo 1 h při 37
°C) s 125I-progesteronem ve zkumavkách potažených králičí
protilátkou vůči progesteronu. Pro vytěsnění progesteronu z bílkovin se
používá danazol. Po inkubaci se obsah zkumavek dekantuje a měří se
radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci
progesteronu ve vzorku. Rozsah měření na základě sedmibodové kalibrace 0,3 –
127 nmol/l. Analytická citlivost je 0,06 (0,1) nmol/l. Preciznost v sérii
je 2,7 – 13,2 %, mezi sériemi 3,9 – 14,8 %; linearita ředění 85 -110 %, zpětný
výtěžek 88 -111 %. Křížová reakce: 5α-pregnan-3,20-dion 9,0 %, ostatní
≤ 3,2 %. Lipémie ruší při stanovení.
ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní
postup, který používá zakotvenou králičí protilátku vůči progesteronu a do
jamek se přidává vzorek nebo kalibrátor a progesteron značený POD. Po inkubaci
(1 h, třepání) a promytí 3x se přidá tetrametylbenzidin s H2O2
v dimetylsulfoxidovém pufru. Roztok se inkubuje 10 – 20 min (třepání), pak
se pipetuje stop činidlo (1 M H2SO4). Absorbance při 450
nm se měří do 20 min a je nepřímo úměrná koncentraci progesteronu ve vzorku
(při vysokých absorbancích lze použít 405 nebo 415 nm). Celý postup probíhá za laboratorní teploty.
Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 0,32 – 190,8 nmol/l (při
vyšších koncentracích se ředí nulovým kalibrátorem). Preciznost v sérii je
10,2 – 10,6 %, mezi sériemi 10,2 – 12,6 %; linearita ředění 81 – 110 %, zpětný
výtěžek 78 – 124 %. Křížová reaktivita 11α-hydroxyprogesteronu je 100 %!,
ostatní ≤ 1,7 %. Silná hemolýza, lipémie a ikterus ruší stanovení. Při
reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.
K dispozici jsou i ELISA soupravy s mikrotitrační
destičkou potaženou kozí protilátkou vůči králičímu IgG (k níž se připojí
králičí protilátka vůči progesteronu) nebo s konjugátem progesteron-ALP a
substrátem p-nitrofenylfosfátem.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že
se do reakční nádobky dávkuje vzorek a konjugát ovčích monoklonálních
protilátek vůči progesteronu s ALP. Po inkubaci se přidají, latexové
mikročástice potažené progesteronem, které obsadí zbylá volné místa protilátky.
Poté se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím,
zatímco imunokomplex s latexovými mikročásticemi se váže na skleněnou
matrici. Po promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se
štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky.
Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,64 – 127,2 nmol/l. Vzorky s hodnotami
progesteronu 127,2 – 2544 nmol/l se ředí manuálně 20x. Analytická senzitivita
je 0,64 nmol/l. Preciznost v sérii je 2,82 – 9,66 %, celková preciznost
metody je 3,41 – 11,71 %. Zpětný výtěžek 98,7 – 101,1 %. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita:
5α-pregnan-3,20-dion 6,3 %, ostatní ≤ 3,2 %.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je
označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá za laboratorní
teploty mezi progesteronem ze vzorku a progesteronem, který je připojený na
sběrný protein o vazebná místa na monoklonální protilátce vůči progesteronu
značené Eu3+. Měřený signál je nepřímo úměrný koncentraci
progesteronu. Analytická citlivost je 0,19 nmol/l, funkční citlivost 0,32
nmol/l. Komerční souprava už není dostupná.
DELFIA je kompetitivní heterogenní fluorescenční
imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu3+ je zesílena
speciálním roztokem, který uvolňuje Eu3+ do roztoku a současně tvoří
jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena kozí
protilátka vůči králičímu IgG. Do mikrotitračních destiček se pipetuje
progesteron ze vzorku (a danazol k uvolnění progesteronu z bílkovin),
polyklonální králičí protilátka a progesteron značený Eu3+ (inkubace
2 h, třepání, laboratorní teplota). Po promytí se přidá zesilovací roztok a
třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615
nm) je nepřímo úměrná koncentraci progesteronu ve vzorku a měří se do 1 h.
Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 0,8 – 120 nmol/l (při vyšších
koncentracích lze ředit). Analytická citlivost je < 0,8 nmol/l. Lipémie
≥ 5 mmol/l a hemolýza ≥ 2 g/l ruší. Při reakci mohou interferovat
heterofilní protilátky.
Chemiluminiscenční analýza v jednokrokovém uspořádání používá monoklonální myší
protilátku vůči fluoresceinu, fluorescein a progesteron zakotvené na
paramagnetických částicích, ke kterým se přidává standard nebo vzorek a
konjugát ovčích monoklonálních protilátek vůči progesteronu značený akridiniumkarboxamidem.
Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M
roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině
progesteronu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace
v rozmezí hodnot 0,32 – 127,2 nmol/l (Vzorky s hodnotami progesteronu >
127,2 nmol/l lze automaticky 10x nebo manuálně ředit 10x, resp. 15x; po ředění
musí být hodnota > 31,8 nmol/l). Preciznost v sérii je 1,5 – 5,5 %,
celkově 2,1 – 6,2 %. Analytická senzitivita 0,32 nmol/l. Ani vysoké koncentrace
hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita:
kortikosteron 4,6 %, ostatní < 4 %.
Podobný
princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako
značkou. Myší monoklonální
protilátka vůči progesteronu značená esterem akridinu se inkubuje spolu se
vzorkem 2,5 min, pak se přidají paramagnetické latexové částice potažené
derivátem progesteronu. Opět se inkubuje 5 min. Po odsátí roztoku a promytí
zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající
luminiscenční záblesk
fotonásobičem při 429 nm.
Vzorky s koncentrací progesteronu > 190,8 nmol/l se ředí automaticky 5x
nebo 10x (koncentrace > 1908 nmol/l lze ředit manuálně). Analytická
citlivost je 0,48 nmol/l. Preciznost v sérii 2,5 – 12,4 %, mezi
sériemi 1,9 – 5,7 %. Linearita ředění je 97,9 – 118 %, zpětný výtěžek 76 – 109
%. Hemolýza, lipémie a
ikterus neruší. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.
CLIA je jednostupňový kompetitivní
zábleskový postup. Magnetické částice jsou potažené protilátkou vůči
progesteronu a progesteron ze vzorku soutěží o její vazebná místa s
progesteronem značeným izoluminolem. Imunoreakce probíhá 21 minut, po
promytí se přidá startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a
fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině
progesteronu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 1,27 – 127,2
nmol/l (vyšší koncentrace lze ředit 10x). Analytická citlivost 1,27 nmol/l,
funkční citlivost 3,18 nmol/l. Preciznost v sérii 4 – 9 %, mezi sériemi 6
– 15 %. Linearita ředění je 88 – 111 %, zpětný výtěžek 91 – 117 %. Křížová
reaktivita: hydroxyprogesteron 3,9 %, ostatní ≤ 1,6 %. Hemolýza a
bilirubin neruší; lipémie vadí.
Jiné
stanovení je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Progesteron v
prostředí pufrovaného roztoku soutěží s progesteronem značeným ALP o
vazebná místa na polyklonální králičí protilátce imobilizované na polystyrenové
kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu
odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje
luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná
koncentraci progesteronu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle
kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě
dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového
kódu činidla. Rozsah měření je 0,6 - 127 nmol/l. Všechny vzorky, jejichž
koncentrace by mohla být mimo kalibrační rozmezí, je třeba naředit. Analytická
citlivost 0,3 nmol/l. Preciznost v sérii 7,0 – 17,4 % %, celková 9,5 % –
21,7 %; linearita ředění 86 – 134 %, zpětný výtěžek 73 – 111 %. Křížová
reaktivita: 11-deoxykortikosteron 1,82 %, ostatní < 0,45 %. Při reakci mohou
interferovat heterofilní protilátky.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530.
Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující progesteron,
paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči králičímu progesteronu a
konjugát progesteronu s ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a
promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát.
Emitované světlo je nepřímo úměrné množství progesteronu. Rozsah měření při 470
nm na základě šestibodové kalibrace je 0,32 – 127,2 nmol/l. (po ředění 3x až do
381,6 nmol/l). Analytická citlivost 0,32 nmol/l. Linearita ředění je 102 – 121
%. Preciznost v sérii 6,11 – 11,19 %, mezi sériemi 7,51 – 9,57 %. Křížová
reaktivita kortikosteron 6,08 %, ostatní ≤ 2,36 %. Při reakci mohou
interferovat heterofilní protilátky.
Chemiluminiscenční
analýza v kompetitivním provedení, kdy progesteron ze vzorku soutěží
s progesteronem značeným křenovou peroxidázou o omezený počet
vazebných míst biotinylované králičí protilátky. Imunokomplex se naváže na
jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci (16 min) se promytím odstraní volný
materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož
oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje
hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové
kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci progesteronu ve vzorku. Rozsah měření
0,253 – 178 nmol/l (vyšší koncentrace progesteronu jsou automaticky ředěné
10x). Analytická senzitivita 0,085 nmol/l, funkční senzitivita 0,253 nmol/l.
Preciznost v sérii 0,8 – 4,9 %, mezi sériemi je 3,1 – 10,7 %. Bilirubin
342 µmol/l a hemoglobin 5g/l neinterferují, lipémie nevadí. Hladiny biotinu
zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Při reakci mohou interferovat
heterofilní protilátky. Křížová reaktivita: 5α-pregnan-3,20-dion 5,2 %,
11-deoxykortikosteron 4,1 %, kortikosteron 3,3 %, ostatní < 2,5 %.
Homogenní chemiluminiscenční
imunoanalýza
v kompetitivním uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI
zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální
biotinylované protilátky vůči progesteronu. První reagencie (Chemibeads) je
potažena derivátem progesteronu a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá
reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační
barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii
Chemibeads. Progesteron ze vzorku soutěží s progesteronem na Chemibeads o
omezené množství vazebných míst na biotinylované protilátce. Poté jsou přidány
reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy
s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z
reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii
Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při
vlnové délce 612 nm a je nepřímo úměrný koncentraci progesteronu ve vzorku.
Analýza trvá 21 min při 37 °C. Rozsah metody na základě pětibodové kalibrace je
0,636 – 127 nmol/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 5x,
manuálně i více). Analytická citlivost je 0,64 nmol/l, funkční citlivost 1,59
nmol/l. Preciznost v sérii 1,3 – 4,8 %, mezi sériemi 1,8 – 6,3 %.
Zpětný výtěžek 93 – 103 %. Hemolýza
ani ikterus neruší. Lipemické vzorky poskytují falešně nižší výsledky.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou
(ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (35 µl) je
inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči
progesteronu, konjugátem derivátu progesteronu s ruthéniovým komplexem a
danazolem (uvolnění progesteronu z bílkovin). Pak se přidají
paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a imunokomplex je vázán na
pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do
měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci
progesteronu ve vzorku. Hemoglobin, chylozita, ikterus a RF (< 2000 kIU/l)
neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se
neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je
použitelná v rozsahu 0,095 – 191 nmol/l. Vyšší koncentrace - vzorky se ředí
manuálně 10x (rozsah do 1910 nmol/l). Analytická citlivost 0,095 nmol/l, funkční
citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,48 nmol/l. Preciznost v sérii CV 1,1 – 2,9 %,
mezi sériemi 1,8 – 5,5 %. Křížová reakce: 5β-dehydroprogesteron 20,7,
ostatní ≤ 1,3 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu
a rutheniu. Při léčbě fenylbutazonem jsou výsledky falešně nižší.
Plynová chromatografie s plameno-ionizační
detekcí nebo využitím detektoru elektronového záchytu je poměrně pracná metoda,
která před nástřikem vyžaduje úpravu vzorku (extrakce a derivatizace).
GC-MS s izotopovou dilucí je doporučena jako
referenční metoda (1991). Využívá se ester progesteronu a heptafluoromáselné
kyseliny a jako vnitřní standard slouží [19-2H3]-progesteron.
Vzorek se opakovaně extrahoval do směsi n-hexan-CHCl3 a progesteron
se dělil v kapilární koloně 15 nebo 25 m. V MS se propojil magnetický
sektor s kvadrupólovým spektrometrem a detekoval se m/z 510 progesteron a
jeho trideuterovaný analog m/z 513.
Preciznost v sérii je 1,65 – 1,75 %, mezi sériemi 2,08
– 2,16 %.
Další kandidátní metoda je izotopová diluce s LC/MS/MS
(2006). Jako vnitřní standard byl použit progesteron13C2.
Separace byla provedena na koloně C18 s mobilní fází
v gradientu voda-acetonitril až čistý acetonitril při 30 °C. Hmotnostní
spektrometr sledoval po elektrospreji při napětí 550 V a teplotě 600
°C přechod m/z 315,2 → 97,1 a u izotopového analogu 317,1 → 99,1.
Preciznost v sérii je 0,1 – 1,4 %, mezi sériemi 0,3 – 0,5 %. Zpětný
výtěžek byl 100,1 – 100,9 %. Detekční limit 1,8 pg.
Certifikované referenční materiály nesou označení CRM 347 a
CRM 348
Toleranční limit EHK: 20 %.
Interference
Snížené hodnoty: amenorea, bulimie, masitá strava,
vegetariánství, věk > 60 let, cvičení, hypertenze v důsledku
těhotenství, postprandiálně; použití gelových separátorů; léky: ampicilin,
cyklofosfamid, danazol, estriol, etinylprogesteron, interferon, perorální
kontraceptiva, prostaglandinF2α.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28