Stanovení
proinzulinu
Synonyma
Proinsulin
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí nalačno v plazmě (antikoagulans heparin) nebo
séru. Materiál je třeba ihned zpracovat, odstřeďovat v chlazené
centrifuze. Při zmrazení na -20 °C je stabilita proinzulinu 12 týdnů, pro
dlouhodobé uchování se doporučuje -70 °C.
Poznámky k
analytické metodě
Přesné měření proinzulinu je poměrně obtížné, protože se rozpadá na
inzulin a C-peptid, které jsou v krvi také přítomné. Teprve syntetická
příprava proinzulinu a následně monoklonální protilátky vůči němu umožnila
vyvinout poměrně spolehlivé metody. RIA postup byl velmi pomalý (navázání
stanovovaného proinzulinu na kozí polyklonální protilátku 48 h, následná
kompetitivní reakce s 125I-proinzulinem 22 h) i když
interference s inzulinem a C-peptidem byla < 0,1 %.
ELISA
v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou
monoklonální protilátkou vůči C-peptidové části proinzulinu. Do jamky se přidá
standard nebo vzorek a inkubuje (třepání) 30 min. Po trojnásobném promytí se
pipetuje monoklonální protilátka vůči inzulinové části proinzulinu s
navázanou křenovou peroxidázou.
Po inkubaci (1 h, třepání) a promytí 3x se přidá chromogen
dimetylbenzidin a reakce probíhající ve tmě 15 min (třepání) je zastavena stop
činidlem (4,9 % H2SO4). Měření při 450 nm nutno provést
do 20 min (možno i bichromaticky proti 405 nebo 630 nm). Celý postup se
realizuje za laboratorní teploty. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt
nadbytku antigenu. Neruší vysoké koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani
heterofilní protilátky. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 0,6 –
100 pmol/l. Preciznost v sérii je 2,9 – 3,2 %, mezi sériemi 1,4 – 2,5 %.
Detekční limit je 0,6 pmol/l (některé metody mají až 0,25 pmol/l). Linearita
ředění 90 – 114 %, zpětný výtěžek 98,4 – 105,2 %. Efekt nadbytku antigenu u
podobné metody nebyl pozorován do 80000 pmol/l.
HPLC metoda rozliší inzulin, proinzulin a jeho štěpy, ale je pracná a
vyžaduje extrakční kroky. Lze také použít LC-MS na reverzní fázi
s gradientem 0,08 % trifluoroctové kyseliny v acetonitrilu proti 0,1
% trifluoroctové kyselině ve vodě.
Interference
Výsledky snižuje: pozdní separace séra, hemolýza (vliv erytrocytárních
peptidáz).
Výsledky snižují: glukokortikoidy, růstový hormon, obezita, aplikace
glukózy.
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28