Stanovení
prolaktinu
Synonyma
PRL, prolactin, laktotropní hormon, LTH, laktotropin
Preanalytická fáze
Odběr krve mezi 8 – 10 h ranní (nejdříve 1 – 2 h po probuzení) do ledové
tříště. Nutno vyloučit stres. Při podezření na hypersekreci je doporučen trojí
odběr po 20 min, nebo po 3 dny ve stejnou raní dobu. Je třeba vyloučit
hemolytické vzorky. Analyt je stabilní v celé krvi 7 d při 15 – 25 °C,
v séru při 20 – 25 °C 1d, 1 – 7d při 4 °C, 1 měsíc – 5 let při -20 °C.
Kromě séra lze použít i plazmu (antikoagulans jen heparin). Opakované zamrazení
se nedoporučuje.
Poznámky k
analytické metodě
Výsledky mezi jednotlivými metodami se liší zejména, protože prolaktin
se vyskytuje ve třech konfiguracích: monomer (23000 – 25000), dimer (50000 –
60000) a nekovalentně vázané agregáty (> 100000) v zastoupení 75:20:5.
RIA v kompetitivním uspořádání, kdy v prvním kroku soutěží
prolaktin ze vzorku s prolaktinem značeným 125I o vazebná místa
na specifické protilátce (16 – 24 h za laboratorní teploty) a v následné
inkubaci (10 min) se přidají magnetické polymerní částice potažené oslím
(anti-ovčím) sérem. Po magnetické separaci se
aktivita změří gama-počítačem (1 min). I když analytické
parametry metody jsou vyhovující, je postup v současnosti příliš pomalý.
IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do
zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou (nebo kozí polyklonální) vůči prolaktinu a přidáním druhé (myší monoklonální) protilátky vůči
prolaktinu značené 125I. Po inkubaci (60 min nebo 120 min, laboratorní teplota, třepání) se supernatant odsaje a
zkumavky se 2x promyjí. Navázaná
aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Na základě šestibodové kalibrace je
rozsah metody 10,6 (2,1) – 3816 (4240) mU/l; analytická citlivost 10,6 (2,1) mU/l, funkční citlivost 13,8 mU/l.
Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 318000 mU/l. Preciznost v sérii
je ≤ 7,09 %, mezi sériemi ≤ 10,11 %. Linearita ředění 88,6 – 117 %, zpětný
výtěžek 81 – 107 %.
ELISA používá dvou
monoklonálních myších protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou a druhá
je zakotvená v jamkách mikrotitrační destičky. Do mikrotitrační destičky
se pipetuje vzorek a přidá se konjugát s peroxidázou. Po inkubaci 1 h a
trojnásobném propláchnutí se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 15
min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (1 M H2SO4) a měří
se při 450 nm do 20 min, kdy absorbance je přímo úměrná koncentraci prolaktinu.
Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje
měření v intervalu 10 – 3200 (jiná
souprava 4240) mU/l (ředění nulovým kalibrátorem 8x). Mez detekce je 10
mU/l. Preciznost v sérii je 6,9 – 11,6 %, mezi sériemi 7,6 – 14,4 %.
Zpětný výtěžek 84,9 – 123,2 %, linearita ředění 86 – 109 %. Silná hemolýza,
lipémie a ikterus ruší analýzu. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené
myší monoklonální protilátkou vůči prolaktinu. Po inkubaci se reakční směs
přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se králičí
polyklonální protilátka vůči prolaktinu značená ALP v pufru TRIS. Po
inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí
na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky.
Šestibodová kalibrace je v rozsahu 12,7 – 4240 mU/l. (Vzorky s hodnotami
prolaktinu > 4240 mU/l lze manuálně ředit nulovým kalibrátorem; hodnota po
ředění musí být > 12,7 mU/l). Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do
212000 mU/l. Preciznost v sérii je 2,81 – 4,13 %, celková preciznost
metody je 3,43 – 6,29 %. Zpětný výtěžek 97 – 106 %. Analytická senzitivita je
12,7 mU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů
neruší. Křížová reaktivita: růstový hormon 1,71 %.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována
jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Sendvičová reakce probíhá 19 min mezi
prolaktinem ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči prolaktinu značenou Eu3+
a monoklonální protilátkou vůči prolaktinu, která je připojena na sběrný
protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených
monoklonálních protilátek k prolaktinu) přímo úměrný hladině prolaktinu.
Rozsah měření je 5 – 4600 mU/l (po automatickém ředění až do 1000000 mU/l). Kalibrace je pouze jednobodová. Analytická
citlivost je 5 mU/l. Preciznost v sérii 0,6 – 3,5 %, mezi sériemi 2,1 – 3,7 %. Linearita
ředění je 91 – 104 %. Neruší hemoglobin
< 7,5 g/l, triacylglyceroly < 9 mmol/l, bilirubin < 684 µmol/l. Efekt
nadbytku antigenu nebyl pozorován do 753000 mU/l.
DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence
Eu3+ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu3+
do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách
je zakotvena protilátka vůči prolaktinu. V sendvičovém uspořádání se
pipetuje prolaktin ze vzorku a specifická protilátka značená Eu3+.
Po inkubaci (90 min třepání) a promytí se přidá zesilovací roztok; reakční směs
se třepe 5 min a celý postup probíhá za laboratorní teploty. Fluorescence
(excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci prolaktinu ve
vzorku a měří se do 1 h. Analytická citlivost je 1,44 mU/l. Rozsah metody na
základě šestibodové kalibrace 1,44 – 5300 mU/l.
AlphaLISA je postup, kdy se do mikrotitrační destičky
pipetuje vzorek, pak se přidá akceptorová kulička potažena protilátkou vůči
prolaktinu a druhá volná protilátka vůči prolaktinu s biotinylovou kotvou.
Proběhne inkubace 60 min při 23 °C. Přidá se donorová kulička potažena
streptavidinem a proběhne druhá inkubace 30 min při 23 °C ve tmě. Takto vznikne
komplex, kde donorová kulička po ozáření 680 nm uvolní singletový kyslík, který
vyvolá fluorescenci akceptorové kuličky 615 nm. Rozsah měření do 6360 mU/l,
analytická citlivost 2,6 mU/l. Preciznost v sérii 5,2 – 9,6 %, mezi
sériemi 6,7 – 14,0 %; zpětný výtěžek 82 – 107 %.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči prolaktinu zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které
se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem
se přidá myší monoklonální protilátka vůči prolaktinu
značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá
1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá
chemiluminiscence je přímo úměrná hladině prolaktinu a sleduje se fotonásobičem
při 429 nm. Metoda dovoluje
měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 12,7 – 4240
mU/l (Vzorky s hodnotami prolaktinu > 4240 mU/l lze ředit automaticky 10x
nebo manuálně 40x; po ředění musí být hodnota > 106 mU/l). Preciznost
v sérii je 2,3 – 3,8 %, celkově 3,3 – 4,7 %. Zpětný výtěžek 92,4 – 101,1
%. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 12,7 mU/l. Ani vysoké
koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Podobný princip zábleskové
luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku
pacientského séra se přidá polyklonální kozí protilátka vůči prolaktinu
značená esterem akridinu. Po inkubaci 5 min při 37 °C se přidá a monoklonální
myší protilátka vůči prolaktinu kovalentně na paramagnetické částice ve
fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C
následuje
odsátí roztoku a promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a
ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na
základě šestibodové kalibrace v rozmezí 6,4 – 4240 mU/l. Vzorky s hladinou
prolaktinu > 4240 mU/l se ředí automaticky 2x nebo 5x (ještě více manuálně).
Analytická citlivost je 6,4 mU/l. Preciznost
v sérii 1,9 – 4,4 %, mezi sériemi 2,0 – 5,3 %. Linearita ředění je 88,9 –
107,8 %, zpětný výtěžek 93,6 – 109,3 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo
ikterus. Efekt
nadbytku antigenu se při měření může projevit kolem 848000 mU/l.
CLIA je další jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy na
magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže prolaktin a
současně se na jeho další epitop připojí druhá myší monoklonální protilátka
vůči prolaktinu značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 10 minut, po promytí
se přidá startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem
se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině prolaktinu. Rozsah
měření na základě dvoubodové kalibrace je 2 – 8000 mU/l. Analytická citlivost
je 2 mU/l, funkční citlivost 4 mU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do
700000 mU/l. Preciznost v sérii je 2,2 – 3,2 %, mezi sériemi 2,9 – 6,4 %.
Linearita ředění je 101 – 106 %, zpětný výtěžek 97 – 101 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani
triacylglyceroly.
Jiné stanovení je založeno
na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem.
Prolaktin se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže
na myší monoklonální protilátku vůči prolaktinu imobilizovanou na polystyrénové
kuličce a současně se na druhé vazebné místo prolaktinu naváže polyklonální
kozí protilátka vůči prolaktinu konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce
probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a
promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který
hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu.
Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita
záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině prolaktinu ve vyšetřovaném vzorku.
Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a
vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do
3180 mU/l (při vyšších koncentracích se ředí diluentem), avšak do hodnoty
466400 mU/l nebyl pozorován efekt nadbytku antigenu. Analytická citlivost je 11
mU/l. Preciznost v sérii 5,7 – 6,8 %, mezi sériemi 6,4 – 9,6 %; zpětný
výtěžek 97 – 121 %, linearita ředění 86 – 119 %. Neinterferují bilirubin,
hemoglobin ani triacylglyceroly.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky
se pipetuje standard nebo vzorek obsahující prolaktin a paramagnetické částice
potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG s navázanou monoklonální myší
protilátkou vůči prolaktinu. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a
promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se druhá kozí protilátkou vůči
prolaktinu značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím
odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát.
Emitované světlo je přímo úměrné množství prolaktinu. Reagencie se musí
skladovat při 2 – 10 °C. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové
kalibrace je 5,3 – 4240 mU/l. (po ředění 10x nulovým kalibrátorem až do 42400
mU/l). Analytická citlivost 5,3 mU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do
636000 mU/l. Preciznost v sérii je 1,54 – 1,61 %, celková 3,32 – 6,92 %.
Linearita ředění 97 – 111 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší.
Chemiluminiscenční
analýza v sendvičovém provedení, kdy prolaktin ze vzorku se váže současně
na ovčí biotinylovanou protilátku vůči prolaktinu a myší monoklonální
protilátka vůči prolaktinu značenou křenovou peroxidázou. Imunokomplex
se zakotví v jamce potažené streptavidinem. Po inkubaci (16 min, 37 °C,
třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát
luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný
acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě
dvojbodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci prolaktinu ve vzorku a odečítá
se mezi 5. a 15. min. Rozsah měření 30,8 – 7000 mU/l (ředění vyšších hodnot
automaticky 10x). Analytická senzitivita 10,7 mU/l, funkční senzitivita 30,8
mU/l. Preciznost v sérii 0,5 – 5,8 %, mezi sériemi je 1,6 – 8,7 %. Ani
vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Hladiny biotinu zůstávají zvýšené do 24 h od
podání.
Alternativní postup v sekvenčním provedení má
myší protilátku přímo zakotvenou v jamce a inkubace se vzorkem trvá 30
min; po čtyřnásobném promytí se přidá konjugát druhé protilátky s POD a
reakční směs je inkubována 30 min. Po čtyřnásobném promytí se do jamky přidává
signální činidlo a odečítá se mezi 5. a 15. min.
Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 6 – 5000 mU/l.
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na
technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích
a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči prolaktinu. První
reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči prolaktinu a
obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta
streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje
s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se
sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-prolaktin-biotinylovaná
protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a
vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem
vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který
se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci.
Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný hladině
prolaktinu ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je na
základě pětibodové kalibrace 4,24 – 5300 mU/l (automatické ředění 4x, manuálně
lze ředit i více). Analytická citlivost je 4,24 mU/l. Preciznost
v sérii 1,4 – 2,9 %, mezi sériemi 1,8 – 4,7 %. Zpětný výtěžek je 98 – 110
%. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1060000 mU/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší. Reagencie nutno
skladovat při 2 – 8 °C.
Stanovení elektrochemiluminiscenční
imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10
µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči
prolaktinu. Pak se přidají monoklonální myší protilátka vůči prolaktinu značená
ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na
který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje
do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině prolaktinu ve
vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 1 – 10000 mU/l. Ředění při vyšších
koncentracích 10x (koncentrace ředěného vzorku musí být > 50 mU/l.
Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 1 mU/l. Preciznost v sérii
0,8 – 4,0 %, mezi sériemi 1,4 – 5,0 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (<
1100 kU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den)
by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt
nadbytku antigenu nebyl pozorován do 270000 mU/l. Reagencie nutno skladovat při
2 – 8 °C. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou
velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu.
Některé laboratoře vyjadřují koncentrace v µg/l (1 µg/l = 21,2 mU/l).
K dispozici jsou mezinárodní standardy WHO IS 83/562 a IS 84/500.
Toleranční limit EHK: do 110 mU/l 17,6 mU/l; při vyšších hodnotách 16 %.
Interference
Hodnoty snižuje: věk po 50. roce, menopausa,
alkohol (60 min po požití), hladovění (1 týden), nízkotučná dieta, malnutrice,
bulimie, hypotermie, bilirubin, tělesný stres, kouření (pokles až 20 %),
vegetariánství; léky: apomorfin, bromokriptin
(Parlodel), L-dopa, cyklosporin, kalcitonin, klonidin, kyselina
valproová, námelové alkaloidy, propranolol, rifampicin, tamoxifen.
Hodnoty zvyšuje: akromegalie, amenorea, anorexie, galaktorea,
těhotenství, puberta (vzestup o 50 %), laktace, jídlo, psychologický stres,
pohlavní styk, dráždění bradavek, tepelný stres, menstruace, hypoglykémie,
spánek (hodnoty zvýšené 2-3x); léky: α-metyldopa, amitriptylin,
amfetaminy, antiepileptika, antihistaminika, antiemetika, antidepresiva,
antihypertenziva, antipsychotika, arginin, benzerazid, butyrofenony, cimetidin,
D-fenfluramin, desipramin, domperidon, enfluran, estrogeny, fenothiazin,
fentanyl, flufenazin, flunarizin, furosemid, haloperidol, chlorpromazin,
imipramin, inhibitory MAO, interleukin-2, inzulin, klomipramin, labetalol,
metadon, metoklopramid, neuroleptika, opiáty, perorální kontraceptiva,
perfenazin, pimozid, prochlorperazin, promazin, ranitidin, reserpin, růstový
hormon, sulpirid, thioridazin, thiotixen, thioxantiny, tryptofan, verapamil,
zimeldin.
Všechny imunoanalýzy mají nespecifickou odezvu na přítomnost
heterofilních protilátek. Makroprolaktin poskytuje falešně vyšší výsledky.
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28