Stanovení prostatické
frakce kyselé fosfatázy (PAP)
Synonyma
Prostatická frakce kyselé fosfatázy (prostatic acid phosphatase – PAP)
patří mezi izoenzymy fosfát-monoester fosfohydrolasy, (EC 3.1.3.2) a nemá proto
ani samostatné EC a může být skryta pod názvy:
kyselá fosfatasa, kyselá monofosfatasa, glycerofosfatasa,
fosfomonoesterasa, kyselá fosfomonoesterasa; kyselá fosfohydrolasa, kyselá
fosfomonoesterhydrolasa, ortofosforečný monoester fosfohydrolasa,
kyselá nukleosiddifosfátfosfatasa, uteroferin.
Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní
pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza.
Mezinárodně uznávaná zkratka enzymu neexistuje, ale běžně se používá označení
AP (Google 413 000), případně ACP (Google 46 300). Upozorňujeme, že
označení AP se používá jak pro alkalickou, tak pro kyselou fosfatázu.
Preanalytická fáze
Vzhledem k dennímu rytmu je třeba odebírat ráno. Odběr
neprovádět po digitálním vyšetření prostaty nebo po její masáži. Nešetrné
zacházení se vzorkem vede k uvolnění ACP z trombocytů a tím ke změně
podílu prostatické frakce. Transport provádět v ledové tříšti. Při
vyšetření se dává přednost plazmě (doporučuje se EDTA, protože heparin výsledky
snižuje) před sérem (aktivita ACP v séru je vyšší). Stabilitu vzorku lze
zvýšit úpravou na pH 6 (hydrogensíran sodný + ředěná kyselina octová). Může se
také stanovovat seminální ACP, případně v moči.
Stabilita vzorku po úpravě na pH 6: 20 - 25 °C: 8 dní, 4 - 8
°C: 8 dní, -20 °C: 4 měsíce; bez úpravy pH: 20 - 25 °C: 2 h, 4 - 8 °C: 8 h, -20
°C: 1 den. Vzhledem k malé stabilitě vzorku se dnes dává přednost
stanovení PSA (řada firem, které vyráběly soupravy PAP, zastavily jejich
výrobu).
Koncentrace ACP v erytrocytech je vyšší než v séru
a hemolýza proto výsledky měření falešně zvyšuje. Zbytky saponátů, fosfátů a
těžké kovy inhibují ACP.
Poznámky k
analytické metodě
Kyselá fosfatáza EC 3.1.3.2. je označení pro skupinu
nespecifických fosfatáz, které katalyzují přesun fosfátové skupiny
z jednoho hydroxylu na druhý hydroxyl, resp. hydrolýzu organických esterů
kyseliny fosforečné na alkohol a kyselinu fosforečnou. Poločas vymizení: 4 dny.
Prostatická frakce kyselé fosfatázy (prostatický izoenzym) se stanovuje
elektroforézou, inhibičními a imunochemickými technikami.
Elektroforéza se provádí na 7 %
polyakrylamidovém gelu v citrátovém pufru, kde se rozliší dva pruhy PAP.
Rychlejší frakci PAP lze pak ještě rozdělit izoelektrickou fokusací (nebo na
chromatografické koloně dietylaminoetylcelulózy) na 5 subfrakcí.
Imunoelektroforéza protisměrná (40 mA, 2
h, 4 °C) byla prováděna na agaróze ve fosfátovém pufru a po vybarvení
α-naftylfosfátem se k imunoreakci použilo králičí PAP antisérum.
Inhibice: PAP = aktivita ACP –
zbytková aktivita po inhibici vínanem sodno-draselným. Mimo obvyklých postupů
pro stanovení ACP byl také publikován substrát 2,6-dichlor-4-acetylfenylfosfát
(měření při 340 nm). K inhibici lze použít také kyselinu vinnou. Rozsah
měření 5 – 2167 nkat/l. Preciznost v sérii 0,48 – 8,3 %, mezi sériemi 1,2
– 1,23 %; zpětný výtěžek 103 – 104 %.
IRMA souprava používá zkumavky
potažené specifickou protilátkou a připojení PAP a druhé protilátky značené 125I
trvá 2 h; po promytí se měří signál gama-počítačem 1 min. Rozsah metody je 0 –
150 µg/l a mez detekce 0,1 µg/l.
ELISA je sendvičový postup, kdy
králičí protilátka vůči prostatickému izoenzymu je zakotvená
v jamkách mikrotitračních destiček
a na ní se připojí PAP, na který se váže konjugát myšího IgG vůči PAP a křenové
peroxidázy. Inkubace se provádí 30 min za laboratorní teploty. Po pětinásobném
promytí jamek (odstranění volného konjugátu) se přidá tetrametylbenzidin a
barevná reakce se vyvolává 15 min, pak se přidá stop činidlo (2 M HCl) a do 5
min se měří absorbance při 450 nm. Rozsah měření je na základě šestibodové
kalibrace 0 – 30 µg/l (vyšší koncentrace se ředí diluentem). Intenzita zbarvení
je přímo úměrná koncentraci PAP. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do
1000 µg/l. Preciznost v sérii 5,7 – 8,9 %, mezi sériemi 5,2 – 6,3 %;
zpětný výtěžek 99 – 102 %.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována
jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Sendvičová reakce probíhá 29 min mezi
prostatickým izoenzymem ACP ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči PAP
značenou Eu3+ a monoklonální protilátkou vůči PAP, která je
připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci
(připojení obou značených monoklonálních protilátek k PAP) přímo úměrný
hladině PAP. Rozsah měření je 0,1 – 50 µg/l (po automatickém ředění až do 15000
µg/l). Kalibrace je
pouze jednobodová. Analytická citlivost je 0,1 µg/l, funkční citlivost 0,4
µg/l. Preciznost v sérii 0,7 – 3,7 %, mezi sériemi
2,4 – 8,7 %. Linearita ředění je 90 – 113 %.
Neruší hemoglobin < 7,5 g/l, triacylglyceroly < 9 mmol/l,
bilirubin < 684 µmol/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 15000
µg/l.
Chemiluminiscenční
analýza je založena na
sekvenční imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. PAP se v
prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem
na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce
probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a
promytí reaguje druhý epitop PAP s polyklonální kozí protilátkou konjugovanou s
alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění
nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje
luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci PAP ve vyšetřovaném
vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a
vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je do 100
µg/l. Vzorky s koncentrací PAP vyšší než 100 µg/l se ředí univerzálním
diluentem. Detekční limit metody: 0,02 µg/l (2 SD). Preciznost v sérii 2,6
– 4,2 %, celkově 9,2 – 12,0 %; zpětný výtěžek:
92 – 113 %, linearita ředění 81 – 114 %. Efekt nadbytku antigenu se do
15000 µg/l neprojevuje. Hemoglobin do koncentrace 5,12 g/l, triacylglyceroly do koncentrace 33,9
mmol/l a bilirubin do koncentrace 342 µmol/l
neinterferují. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat
s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji
interferenci při imunoanalýze.
Certifikovaný referenční materiál je
k dispozici pro prostatický izoenzym pod označením BCR 410 (Sigma-Aldrich).
Referenční metoda neexistuje.
Intraindividuální variabilita: 8,9 %, minimální
signifikantní změna: 26,2 %.
Toleranční limit EHK: 21 % (pouze pro prostatický
izoenzym).
Interference
Aktivitu kyselé fosfatázy snižují: fluoridy, fosfáty, měď, oxaláty,
tekutá mýdla (10 – 37 %), aj.
Aktivitu kyselé fosfatázy zvyšují: bilirubin, hemoglobin, kyselina
acetoctová, kyselina gentisová, kyselina homogentisová, aj.
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28