Stanovení protilátek
vůči glutamátdekarboxyláze
Synonyma
anti-GAD, GAD65;
anti-ostrůvkové protilátky, protilátky proti cytoplazmě
ostrůvkových buněk (ICA), protilátky proti inzulinu (IAA), protilátky proti dekarboxyláze
kyseliny glutamové (GADA), anti-GAD65 protilátky, protilátky asociované s
inzulinomem-2 (IA-2A), anti-ICA512 protilátky, protilátky proti proteinu
podobnému tyrozin-fosfatáze;
GAD65 Islet Cell Antibody; Glutamic Acid Decarboxylase
Antibody; 64K Antibody; Anti-GAD Antibodies; AntiGlutamic Acid Decarboxylase
Ab; Beta Cell Antibody; GAD65 Antibody; Glutamic Decarboxylase Antibodies;
Islet Cell Antibody.
Preanalytická fáze
Odebraný vzorek odstředit v chlazené centrifuze.
Stabilita protilátek v séru: 2 – 4 h při 20 – 25 °C, 1 – 5 d při 4 – 8 °C,
3 - 12 měsíců při -20 °C. Lze také použít plazmu (antikoagulans EDTA nebo
heparin). Je třeba zabránit hemolýze. Ruší lipémie. Nedoporučuje se opakované
rozmrazení.
Poznámky k analytické
metodě
RIA postup začíná imunoreakcí stanovovaných
protilátek s glutamátdekarboxylázou, značenou 125I (která je
v přebytku). Po inkubaci (2 h) se přidá protein A, zakotvený na pevné fázi
(granulky) a dochází k precipitaci (1 h). K precipitaci lze použít i protilátku vůči lidskému IgG, ale
analýza pak trvá déle. Přidá se pufr, zkumavky se odstředí, supernatant
s volnou 125I-GAD se odsaje a granulky se měří
v gama-počítači. Radioaktivita je přímo úměrná množství protilátek. Rozsah
metody na základě šestibodové kalibrace je 1 – 300 kU/l. Citlivost metody je
0,11 kU/l. Preciznost v sérii 3,6 – 3,7 %, mezi sériemi 4,9 – 7,0 %.
ELISA se provádí v mikrotitračních destičkách se
zakotveným antigenem. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak
se roztoky inkubují (2 h, 37 °C). Obsah jamek se odsaje. Přidá se druhá protilátka
značená křenovou peroxidázou, roztok se inkubuje (1 h, 37 °C) a obsah jamek se
odsaje, 5x promyje a vyklepne na filtrační papír. Přidá se substrát
tetrametylbenzidin a následuje další inkubace (15 - 25 min, 37 °C) ve tmě.
Další krok je přidání stop činidla (ředěná kyselina sírová) a okamžité měření
při 450±10 nm. Stanovení se provádí za laboratorní teploty. Sedmibodová
kalibrace umožňuje měřit v rozsahu 0(?) – 100 µg/l. Detekční limit je 1,56
µg/l. Preciznost v sérii < 10 %, mezi sériemi < 12 %. Určitý problém
je vztah mezi koncentrací (µg/l) a titrem protilátek (kU/l), který není
v soupravě definován.
Jiný postup ELISA začíná stejně, ale inkubace kalibrátorů a
vzorků je kratší (1 h, třepání). Roztoky se odsají, jamky 3x promyjí a nakonec
se destička vyklepne na filtrační papír. Druhý krok je přidání další protilátky
s biotinylovou kotvou a následná inkubace (1 h, třepání). Roztoky se
odsají, jamky 3x promyjí a nakonec se destička vyklepne na filtrační papír.
Třetím krokem je přidání streptavidinu označeného POD a opět inkubace (20 min,
třepání). Roztoky se odsají, jamky 3x promyjí a nakonec se destička vyklepne na
filtrační papír. Přidá se tetrametylbenzidin a reakce se po 20 min ve tmě
zastaví stop činidlem (5 s třepání). Destička se měří při 405 i při 450
nm. Vyšší koncentrace (≥ 200 kU/l) se měří při 405 nm, nižší koncentrace
při 450 nm. Analýza se provádí za laboratorní teploty. Rozsah měření při
šestibodové kalibraci je 5 – 2000 kU/l. Mez detekce (2 SD nulového blanku) je
0,57 kU/l. Preciznost v sérii 7,3 – 8,5 %. Hemolýza, chylozita a ikterus
neruší.
Další varianta ELISA také začíná imunoreakcí stanovovaných
protilátek se zakotveným antigenem (inkubace 1 h). Roztoky se odsají, jamky 3x
promyjí a nakonec se destička vyklepne na filtrační papír. Pak se přidá druhá
protilátka (kozí) značená ALP a inkubujeme 1 h ve tmě. Nakonec se přidá
substrát 4-nitrofenylfosfát, inkubujeme 30 min ve tmě a vývoj barevné reakce se
zastaví roztokem 1M hydroxidu sodného. Analýza se provádí za laboratorní
teploty. Měření se provádí při 405 nm.
Interference
Obecně ruší přítomnost heretofilních protilátek.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28