Stanovení protilátek
vůči mikrosomům štítné žlázy (anti-TPO)
Synonyma
anti-mikrosomy, protilátky vůči tyreoidální peroxidáze, Anti-TPO, Anti TPO;
Anti-thyroid peroxidase antibodies, anti-TPO
antibodies, Anti-Thyroid Peroxidase Antibodies (TPO), Thyroid peroxidase
antibody, Thyroid antimicrosomal antibody, TPO-Ab, Anti-Microsomal Antibodies (AMA), Antimicrosomal
antibody, Microsomal antibody.
Poznámka: přestože
v literatuře jsou výše uvedené názvy používány jako synonyma, není to
zcela přesné; tyroidní peroxidáza je hlavním, ale nikoliv jediným antigenem
mikrosomů, takže název anti-mikrosomy je obecnější (širší) než anti-TPO.
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát
lithný nebo sodný, EDTA, citronan, fluorid, šťavelan). Stabilita protilátek: 1
– 2 d při 20 – 24 °C, 3 – 7 d při 4 – 8 °C, 1 – 3 měsíce při -20 °C.
Poznámky k
analytické metodě
Pasivní hemaglutinace využívá taninované erytrocyty (nebo gelové
partikule) potažené mikrosomy ze štítné žlázy. Po smíchání se vzorkem se
stanovované protilátky naváží na zakotvený antigen a dochází k aglutinaci.
Obvykle se provádí ředění a sleduje se titr, při kterém ještě dochází
k hemaglutinaci. Stanovení je semikvantitativní a provedení je jednoduché.
Komerční soupravy jsou dostupné.
Metody, které používají citlivější markery, než erytrocyty, jsou také
specifičtější.
RIA protilátek proti lidské TPO je
kompetitivní stanovení. Neznámé vzorky, kontrolní vzorky a kalibrátory se spolu
s 125I-TPO inkubují (60 min, laboratorní teplota, třepání) ve
zkumavkách potažených dvěma monoklonálními protilátkami vůči TPO. Po inkubaci
se obsah zkumavek odsaje, promyje a navázaná aktivita se změří gama-počítačem
(1 min). Sestrojí se šestibodová kalibrační křivka a z ní se odečtou
koncentrace protilátek vůči TPO v neznámých vzorcích (nepřímá úměra
signálu). Rozsah metody je 2 – 2500 kU/l. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je
6,1 kU /l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 2 kU /l.
Preciznost v sérii ≤ 12,4 %, mezi sériemi je ≤ 12,5 %. Ruší
hemolýza a chylozita. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s
imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in
vitro imunologickým stanovením.
Jiná varianta používá zkumavky potažené streptavidinem. Kompetice pak
probíhá mezi lidskou anti-TPO s biotinovou kotvou a anti-TPO ze vzorku o
vazbu s 125I-TPO. Po inkubaci (2
h, laboratorní teplota, třepání) se obsah zkumavek odsaje, promyje a navázaná
aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Sestrojí se pětibodová kalibrační
křivka a z ní se odečtou koncentrace protilátek vůči TPO v neznámých
vzorcích (nepřímá úměra signálu). Rozsah metody je 1,9 – 1900 kU/l. Funkční
senzitivita (CV ≤ 20 %) je 6 kU/l, analytická senzitivita (2 SD nulového
kalibrátoru) 1,9 /l. Preciznost v sérii 4,4 – 9,3, mezi sériemi je 5,4 –
12,4 %.
IRMA postup začíná pipetováním ředěného séra do zkumavek potažených TPO. Po
inkubace (2 h, 37 °C) se supernatant odsaje a zkumavky se promyjí. Dále se
přidá 125I-Protein A. Opět se inkubuje (2 h, 37 °C), supernatant
odsaje a zkumavky se promyjí. Navázaná
aktivita se změří gama-počítačem (2 min). Preciznost v sérii je 2,8 – 11,6
%, mezi sériemi 12 – 20 %.
ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotveným streptavidinem. První se
pipetuje kalibrátor nebo ředěný vzorek a potom biotinylovaná anti-TPO. Po
inkubaci (60 min) se odsaje roztok, jamky se 3x promyjí. Přidá se protilátka
vůči lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Dále následuje inkubace 30
min., roztok se odsaje, jamky se 3x promyjí a pak se přidá tetrametylbenzidin
s H2O2 a za 15 min stop činidlo (1 M HCl). Měření se
provádí bichromaticky při 450 nm (proti 620 – 630 nm) do 30 min na základě
šestibodové kalibrace v rozmezí 1,5 – 500 kU/l. Analýza se provádí za
laboratorní teploty. Silná hemolýza a lipémie ruší. Analytická citlivost (2 SD
nulového kalibrátoru) je 0,92 kU/l. Preciznost v sérii 3,8 – 5,7 %, mezi
sériemi 4,5 – 6,8 %. Tyreoglobulin při stanovení neinterferuje.
Jiná ELISA souprava má v jamkách přímo zakotvenou rekombinantní
tyreoidální peroxidázu. Tetrametylbenzidin nemusí obsahovat peroxid vodíku a
jako stop činidlo se může použít ředěná kyselina sírová (0,2 M). Barevná reakce
se provádí ve tmě a první sekvence sendvičové rekce je kratší (pouze 30 min).
Preciznost je srovnatelná s předchozí metodou. Analytická citlivost je <
0,5 kU/l. Rozsah měření do 320 kU/l.
K dispozici je také ELISA souprava umožňující stanovit současně
anti-TG a anti-TPO.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný fosfátový pufrem a poté latexové mikročástice
potažené tyreoidální peroxidázou. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu
a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí protilátka vůči
lidskému IgG značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje
substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon,
jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu
1 – 1000 kU/l. (Vzorky s hodnotami anti-TPO > 1000 kU/l lze automaticky nebo
manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x – hodnota po
ředění musí být > 8 kU/l). Preciznost v sérii je 5,8 – 11,1 %, celková
preciznost metody je 8,1 – 12,4 % linearita ředění 94,0 – 114,2 %. Analytická
senzitivita je 1 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů
neruší.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována
jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá 19 min mezi anti-TPO
ze vzorku a monoklonální anti-TPO-Eu3+ o vazbu na tyreoidální
peroxidázu, která je připojena přes monoklonální anti-TPO na sběrný protein.
Měřený signál je po kompetitivní imunoreakci nepřímo úměrný hladině anti-TPO.
Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 10 – 5000 kU/l (po
automatickém ředění až do 500000 kU/l).
Analytická citlivost je 10 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 50 kU/l. Preciznost v sérii 2,1 – 7,6 %, mezi
sériemi 5,8 – 16 %. Linearita ředění je 80 – 120 %. Anti-TG neruší do 1735
kU/l, hemoglobin < 5 g/l, triacylglyceroly < 2,6 mmol/l, bilirubin <
684 µmol/l, RF < 1200 kU/l.
DELFIA (Dissociation-enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay) používá
mikrotitrační destičky potažené streptavidinem. V první inkubaci (2h,
třepání) se naváže biotinylovaná tyreoidální peroxidáza, kalibrátor nebo vzorek
(se stanovovanou anti-TPO) a současně se naváže na druhý paratop protilátky
TPO-Eu3+. Po promytí 6x se přidá zesilující roztok, inkubuje se 15
min a pak se měří fluorescence (excitace 320 nm, emise 615 nm). Rozsah metody
je 1,19 – 4140 kU/l. Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Preciznost
v sérii 5,4 – 7,0 %, mezi sériemi 9,8 – 13,0 %.
Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém
uspořádání používá tyreoidální peroxidázu zakotvenou na paramagnetických
částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a
promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému
IgG značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se
přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá
chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-TPO a sleduje se fotonásobičem
při 429 nm. Metoda dovoluje
měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 3 – 1000
kU/l (Vzorky s hodnotami anti-TPO > 1000 kU/l lze automaticky nebo manuálně
ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 2x, při hodnotách > 2000
kU/l se ředí manuálně). Preciznost v sérii 1,8 – 9,5 %, celkově 2,5 – 9,8
%; linearita 95,7 – 103,1 %. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 0,5 kU
/l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 0,16 kU /l. Ani vysoké
koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní
protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v
komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
Podobný princip zábleskové
luminiscence, avšak v sekvenčním a kompetitivním uspořádání lze použít
s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku pacientského séra se
přidá lidská tyreoidální peroxidáza spojená s monoklonální myší
protilátkou vůči TPO značenou esterem akridinu ve fosfátovém pufru
hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C se přidá monoklonální
myší protilátka vůči TPO, která je vázaná kovalentně na paramagnetické částice
ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Reakce probíhá 5 min při
37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá
peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem
při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky s hladinou anti-TPO > 1300
kU/l se ředí 5x, což dovoluje měření do 6500 kU/l. Analytická citlivost je 15
kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %)
25
kU/l. Preciznost v sérii 1,6 – 4,1
%, mezi sériemi 3,4 – 8,0 %. Linearita ředění je 83,7 – 136,2 %, zpětný výtěžek
93,3 – 115,1 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Heterofilní
protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny
obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické
částice potažené rekombinantní TPO naváže anti-TPO během první inkubace (10
min) a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min)
polyklonální kozí protilátka vůči lidskému IgG značená izoluminolem. Po promytí
se přidá startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem
se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině anti-TPO. Rozsah měření
je na základě dvoubodové kalibrace 1 – 2000 kU/l (vzorky s koncentrací anti-TPO přesahující rozsah
měření lze ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,6 kU/l,
funkční citlivost 1,0 kU/l. Preciznost
v sérii 3,6 – 7,4 %, mezi sériemi 4,7 – 12,7 %. Linearita ředění je 89 –
101 %, zpětný výtěžek 92 – 100 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu,
bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Jiné
stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci. Protilátky proti
tyreoidální peroxidáze se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových
bílkovin bez protilátek anti-TG/anti-TPO váží na vysoce purifikovanou
tyreoidální peroxidázu imobilizovanou na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá
30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí
se na druhé vazebné místo anti-TPO naváže monoklonální myší protilátka vůči
lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37
°C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá
substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s
alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za
vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je
přímo úměrná koncentraci anti-TG ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou
stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena
na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 1000 kU/l, avšak do
hodnoty 16624 kU/l nebyl pozorován efekt nadbytku protilátky. Sérum je před
analýzou automaticky ředěno analyzátorem 100x a diluent s bílkovinnou
matricí bez protilátek anti-TG a anti-TPO se stabilizátorem je součástí
soupravy. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 5 kU/l. Preciznost
v sérii (177 kU/l) < 7,5 %, v čase (53 kU/l) < 7,3 %, zpětný
výtěžek 85 – 103 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s
imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in
vitro imunologickým stanovením. Neinterferují bilirubin (< 342 µmol/l),
hemoglobin (< 3,81 g/l), lipidy (< 30 g/l).
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky
se pipetuje standard nebo vzorek obsahující stanovované protilátky a
paramagnetické částice potažené TPO. Po inkubaci se separací v magnetickém poli
a promytím odstraní nenavázané složky a přidá protein A značený ALP. Následuje
druhá inkubace, separace v magnetickém poli a promytí. Dále se přidá
chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-TPO.
Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,3 – 1000 kU/l.
Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 10000 kU/l. Preciznost v sérii
je 6,3 – 7,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou
reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a
způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je temperován
s polyklonálními ovčími protilátkami vůči TPO značenými ruthéniovým
komplexem. Po přidání biotinylované rekombinantní TPO a paramagnetických částic
potažených streptavidinem dochází ke kompetici o vazebná místa na anti-TPO a
imunokomplex se naváže na paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem
pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky,
kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky
se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu
vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná hladině anti-TPO ve vzorku. Hemolýza,
chylozita, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými
dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od
posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 5 – 600 kU/l. Ředění
při vyšších koncentracích 5x, je-li hodnota po ředění > 200 kU/l
(autoprotilátky odpovídají nelineárně). Analytická citlivost (2 SD nulového
kalibrátoru) je < 5 kU/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 2,5 – 7,0 %, mezi
sériemi 7,6 – 24,4 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a
rutheniu. Anti-TG < 394 kU/l stanovení neovlivňovaly.
Mezinárodní standard je označen MRC 66/387.
Interference
Hodnoty snížené: při velmi vysokém věku (> 90 let).
Hodnoty zvýšené: u 5 – 10 % zdravých (po šedesátce více v důsledku
asymptomatické lymfocytární tyreoitidy, někdy interferují anti-TG, z léků
interferon α.
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28