Stanovení protilátek
vůči tyreoglobulinu (anti-TG)
Synonyma
Thyroglobulin Antibody, Antithyroglobulin Antibody, Tg Ab, Thyroid
Antiglobulin Antibody
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát
lithný nebo EDTA). Stabilita protilátek 8 – 48 h při 20 – 25 °C, 2 - 7 d při 4
– 8 °C, 1 – 3 měsíce při -20 °C. Ředěné vzorky lze skladovat v chladu 6
dní. Opakované zamrazení se nedoporučuje.
Poznámky k
analytické metodě
Pasivní hemaglutinace využívá taninované erytrocyty potažené
tyreoglobulinem. Po smíchání se vzorkem se stanovované protilátky naváží na
zakotvený antigen a dochází k aglutinaci. Sérum je nutné před reakcí
deaktivovat při 56 °C, aby se odstranila interference komplementu a TBG.
Obvykle se provádí ředění a sleduje se titr, při kterém ještě dochází
k hemaglutinaci.
Metody, které používají citlivější markery, než erytrocyty, jsou také
specifičtější.
IRMA v sendvičovém uspořádání začíná imunoreakcí (1 h 37 °C nebo 90 min
za laboratorní teploty + třepání) ředěných stanovovaných protilátek
s tyreoglobulinem, vázaným na stěnách zkumavek. Po promytí (3x) se přidá 125I-protein
A, následně se roztok inkubuje 1 h při 37 °C (nebo za laboratorní teploty +
třepání). Po odstátí (případně i promytí) se měří radioaktivita ve zkumavkách
(1 min), která je přímo úměrná množství stanovovaných protilátek. Rozsah metody
je 2,02 – 3000 kU/l. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 19,7 kU /l,
analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 2,02 kU /l. Preciznost
v sérii ≤ 10,4 %, mezi sériemi je 10,2 %. Ruší hemolýza, chylozita i
ikterus. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny
obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
Pokud se značení a reakce se provádí volně v roztoku za vzniku
precipitátu 125I-tyreoglobulin–anti-TG–protein A, dosáhne se
citlivosti až 0,2 kU/l.
ELISA probíhá v mikrotitračních destičkách potažených lidským
tyreoglobulinem. Po navázání stanovované protilátky (30 min, 37 °C) a
promytí (3x) se váže ve tmě na druhý paratop protilátka vůči IgG, značená POD
(30 min, laboratorní teplota). Po promytí (3x) se enzym detekuje reakcí
s tetrametylbenzidinem (15 min, laboratorní teplota) ve tmě, která se
zastaví stop činidlem (0,4 M H2SO4). Rozsah metody je 10
– 2000 kU/l (Jiné soupravy až do 9000
kU/l). Uváděná senzitivita je 97,1 % a specifita 87,5 %. Preciznost
v sérii je 1,2 – 2,1 %, mezi sériemi 3,9 – 8,5 %. Jako substrát lze použít i o-fenylendiamin. Detekční limit je pak 3- 5
kU/l.
Jiný postup využívá mikrotitrační destičky potažené streptavidinem.
Do jamek se pipetuje ředěný vzorek nebo kalibrátor a poté tyreoglobulin
s biotinovou kotvou. Po inkubaci a propláchnutí se přidá protilátka proti
lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Opět se inkubuje a propláchne, pak
se přidá substrát tetrametylbenzidin s H2O2 a
barevná reakce se posléze zastaví stop činidlem (1 M HCl). Měří se
bichromaticky 450/620 nm. Šestibodová kalibrace dovoluje měření do 2500 kU/l.
Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 1,94 kU/l. Preciznost
v sérii je 3,6 – 5,0 %, mezi sériemi 4,0 – 5,3 %. Chylozita a hemolýza
stanovení ruší, ale nevadí anti-TPO ani vysoký RF.
Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční
nádobky dávkuje vzorek ředěný fosfátový pufrem a poté latexové mikročástice
potažené purifikovaným tyreoglobulinem. Po inkubaci se reakční směs přenese na
fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí protilátka vůči
lidskému IgG značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje
substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon,
jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu
2 – 1000 kU/l. (Vzorky s hodnotami anti-TG > 1000 kU/l lze automaticky nebo
manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x – hodnota po
ředění musí být > 25 kU/l). Preciznost v sérii je 4,1 – 7,4 %, celková
preciznost metody je 7,0 – 12,9 % linearita ředění 84,3 – 109,9 %. Analytická
senzitivita je 2 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a
triacylglycerolů neruší.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována
jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá 29 min mezi anti-TG
ze vzorku a polyklonální anti-TG připojenou na sběrný protein o vazbu na
tyreoglobulin-Eu3+. Měřený signál je po kompetitivní imunoreakci
nepřímo úměrný hladině anti-TG. Na základě jednobodové kalibrace rozsah měření
je 10 – 850 kU/l (po automatickém ředění až do 500000 kU/l). Analytická citlivost je 10 kU/l, funkční citlivost
(CV
≤ 20 %) 33 kU/l. Preciznost v sérii 1,5 – 3,5 %, mezi
sériemi 6,8 – 20 %. Linearita ředění je 85 – 112 %. Anti-TPO neruší do 1000
kU/l, tyreoglobulin do 150 µg/l, hemoglobin < 2,5 g/l, triacylglyceroly <
5,6 mmol/l, bilirubin < 684 µmol/l.
Chemiluminiscenční
analýza v sendvičovém uspořádání
používá lidský tyreoglobulin zakotvený na paramagnetických částicích ke kterému
se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem
se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená akridiniumkarboxamidem.
Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok
hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-TG a
sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje
měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 1 – 1000
kU/l (Vzorky s hodnotami anti-TG > 1000 kU/l lze automaticky nebo manuálně
ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x, při hodnotách >
10000 kU/l se ředí manuálně). Preciznost v sérii 1,7 – 6,6 %, celkově 2,3
– 8,2 %; linearita 93,5 – 117,9 %. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je
0,31 kU /l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 0,07 kU /l.
Efekt nadbytku protilátek nebyl pozorován ani při hodnotě 100000 kU/l. Ani
vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.
Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny
obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
Podobný princip
zábleskové luminiscence, avšak v kompetitivním uspořádání lze použít
s esterem akridinu jako značkou. Protilátka
proti tyreoglobulinu ve vzorku soutěží s polyklonální lidskou anti-TG
protilátkou vázanou na polyklonální kozí protilátku vůči lidskému IgG
kovalentně vázanou na paramagnetické latexové částice o omezené množství
lidského tyreoglobulinu, značeného esterem akridinu. První krok je temperování
vzorku na 37 °C (4,6 min). Dále se pipetuje lidský tyreoglobulin, značený
esterem akridinu a roztok se temperuje na 37 °C (3 min). Nakonec se přidá
polyklonální lidská anti-TG protilátka vázaná na polyklonální kozí protilátku
vůči lidskému IgG kovalentně vázanou na paramagnetické latexové částice a nechá
se proběhnout kompetitivní imunoreakce (6,3 min, 37 °C). Po odsátí roztoku a
promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří
vznikající luminiscenční záblesk
fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky s hladinou anti-TG > 500 kU/l se
ředí 5x. Analytická citlivost je 10 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 30 kU/l. Preciznost v sérii 3,9 – 6,3 %, mezi
sériemi 4,2 – 7,0 %. Linearita ředění je 80,8 – 117,2 %, zpětný výtěžek 87,3 –
102,3 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Heterofilní
protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny
obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým
stanovením.
CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické
částice potažené tyreoglobulinem naváže anti-TG během první inkubace (10 min) a
po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min)
polyklonální kozí protilátka vůči lidskému IgG značená izoluminolem. Po promytí
se přidá startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem
se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině anti-TG. Rozsah měření
je na základě dvoubodové kalibrace 5 – 5000 kU/l (vzorky s koncentrací anti-TG přesahující rozsah měření
lze ředit diluentem dle potřeby). Efekt nadbytku protilátky nebyl pozorován
do 259000 kU/l. Analytická citlivost je 5 kU/l, funkční citlivost 10 kU/l. Preciznost v sérii 2,3 – 8,6 %, mezi sériemi 4,4
– 10,8 %. Linearita ředění je 89,6 – 109,1 %, zpětný výtěžek 95 – 109 %. Ani
vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Až do koncentrace
25 mg/l nebyla zjištěna interference TPO.
Jiné
stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci. Protilátky proti
tyreoglobulinu se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin
bez protilátek anti-TG/anti-TPO váží na vysoce purifikovaný tyreoglobulin
imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po
odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se na druhé vazebné
místo anti-TG naváže monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná
s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění
nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem.
Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-TG ve
vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je
pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v
kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah
kalibrace je do 3000 kU/l, avšak do hodnoty 55552 kU/l nebyl pozorován efekt
nadbytku protilátky. Sérum je před analýzou automaticky ředěno analyzátorem
100x a diluent s bílkovinnou matricí bez protilátek anti-TG a anti-TPO se
stabilizátorem je součástí soupravy. V případě výsledku > 3000 kU/l se
ředěný vzorek dále naředí diluentem v poměru 1 + 20 a výsledek z analyzátoru se
násobí 21x. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 2,2 kU/l. Preciznost
v sérii (43 kU/l) < 5,0 %, v čase (381 kU/l) < 5,9 %, zpětný
výtěžek 73 -103 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s
imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in
vitro imunologickým stanovením. Neinterferují bilirubin (< 342 µmol/l),
hemoglobin (< 3,81 g/l), lipidy (< 50 g/l).
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky
se pipetuje standard nebo vzorek a paramagnetické částice potažené
tyreoglobulinem. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní
nenavázané složky a přidá tyreoglobulin značený ALP. Následuje druhá inkubace,
separace v magnetickém poli a promytí. Dále se přidá chemiluminiscenční
substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-TG. Rozsah měření při
470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,9 – 2500 kU/l. Efekt nadbytku
protilátky nebyl prokázán do 350000 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu,
bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském
séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech
soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován
s biotinylovaným tyreoglobulinem a stanovované protilátky se vážou na
antigen. Po přidání protilátek anti-TG značených ruthéniovým komplexem dochází
ke kompetici o vazebná místa na tyreoglobulinu a imunokomplex se naváže na
paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem pomocí
biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se
mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se
odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná hladině anti-TG ve vzorku. Hemolýza,
chylozita, ikterus a RF (< 300 kIU/l) neruší, ale vadí tyreoglobulin > 2
mg/l. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli
odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v
rozsahu 10 – 4000 kU/l. Ředění při vyšších koncentracích není možné
(autoprotilátky odpovídají nelineárně). Analytická citlivost (2 SD nulového
kalibrátoru) je < 10 kU/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,3 – 5,6 %, mezi
sériemi 2,1 – 8,7 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a
rutheniu.
Mezinárodní standard je označen MRC 65/93.
Interference
Zvýšené hodnoty se objevují i u zdravých ve vyšším věku (6 – 7 %).
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28