Stanovení testosteronu
Synonyma
17-β-hydroxy-10-α-androst-4-en-3-one,
17-β-hydroxy-4-androsten-3-one, 17-β-hydroxyandrost-4-en-3-one, 17-β-hydroxy-4-androsten-3-one,
17-hydroxy-10,13-dimethyl-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-one,
17-hydroxy-(17- β)-androst-4-en-3-one,
androst-4-en-17-β-hydroxy-3-one, 4-androsten-17-β-ol-3-one, 9-β, 10-α-testosterone
Androlin, Andronaq, Andrusol,
Cristerona T, Geno-cristaux gremy, Homosteron, Homosterone, Malerone,
Mertestate, Neo-Hombreol F, Neotestis,
Oreton, Oreton F, Orquisteron, Perandren,
Percutacrine androgenique, Primotest, Primoteston, Sustanon,
Sustanone, Synandrol F, Teslen, Testandrone,
Testiculosterone, Testobase,
Testopropon, Testosteroid,
Testosteron, Testoviron, Testoviron Schering, Testoviron T, Testrone,
Testryl,
trans-Testosterone, Virormone, Virosterone
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparin),
případně v moči. U žen 3. den cyklu mezi 8. a 10. h (tři odběry v 20 min
intervalu), u mužů postačuje jeden odběr v 8 h; je třeba vyloučit
hemolýzu, chylozitu a ikterus. Moč pro analýzu se sbírá 24 h. Stabilita analytu
(nutno separovat brzy sérum od krvinek) 1 – 2 d při 20 – 25 °C, 3 – 7 d při 4 –
8 °C, 1 – 4 měsíce při -20 °C. Opakované rozmrazení se nedoporučuje.
Poznámky k
analytické metodě
RIA je kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány 3 h
při 37 °C s 125I-testosteronem ve zkumavkách potažených
protilátkou vůči testosteronu. Po inkubaci se obsah zkumavek dekantuje a měří
se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci
testosteronu ve vzorku. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace 0,09 –
69,4 nmol/l. Analytická citlivost je 0,09 nmol/l. Preciznost v sérii je
7,2 – 14,8 %, mezi sériemi 6,9 – 15 %; linearita ředění 83 – 129 %, zpětný
výtěžek 91 – 117 %. Křížová reakce: 5α-dihydrotestosteron 10 %, 19-nortestosteron
5 %, ostatní ≤ 2,0 %.
ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, který používá
zakotvenou protilátku (králičí
polyklonální) vůči testosteronu a do jamek se přidává vzorek nebo
kalibrátor a testosteron značený POD. Po inkubaci (1 h, 37 °C) a promytí 3x se
přidá tetrametylbenzidin s H2O2. Roztok se inkubuje
15 min ve tmě (laboratorní teplota), pak se pipetuje stop činidlo (1 M H2SO4).
Absorbance při 450 nm se měří do 30 min a je nepřímo úměrná koncentraci testosteronu
ve vzorku. Na základě pětibodové kalibrace je rozsah metody 0,24 – 55,5 nmol/l.
Preciznost v sérii je ≤ 5,8 %, mezi sériemi ≤ 10,5 %; zpětný
výtěžek 98,1 – 112,9 %, linearita ředění
95,0 – 118,1 %. Křížová reaktivita: dihydroxytestosteron 16 %, ostatní
≤ 0,8 %.
Imunoanalýza na
mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek a latexové
mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči testosteronu a směs se
nechá inkubovat; pak se přidá konjugát testosteronu s ALP, který se naváže
na zbylá volná místa na protilátce. Po inkubaci se reakční směs přenese na
fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím, zatímco imunokomplex
s latexovými mikročásticemi se váže na skleněnou matrici. Po promytí se
dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující
umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky a signál je nepřímo úměrný
koncentraci testosteronu ve vzorku. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,4
– 52 nmol/l. Vzorky s hodnotami testosteronu > 52 nmol/l se ředí manuálně
(doporučené ředění 4x) tak, aby koncentrace ředěného vzorku byla > 3,47
nmol/l. Analytická citlivost je 0,4 nmol/l, funkční citlivost 0,7 nmol/l.
Preciznost v sérii je 3,9 – 8,3 %, celková preciznost metody je 6,0 – 9,3
%. Linearita ředění 99,3 – 134,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (<
7,5 g/l), bilirubinu (< 342 µmol/l) a triacylglycerolů (< 5,65 mmol/l)
neruší. Heterofilní protilátky v lidském
séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž
způsobuji interferenci při imunoanalýze.
Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována
jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří
fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu3+
v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm
s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál
665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky
v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu
a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá za laboratorní
teploty mezi testosteronem ze vzorku a testosteronem, který je připojený na
sběrný protein o vazebná místa na monoklonální protilátce vůči testosteronu
značené Eu3+. Měřený signál je nepřímo úměrný koncentraci
testosteronu. Komerční souprava už není dostupná.
DELFIA je kompetitivní heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená
fluorescence Eu3+ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu3+
do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách
je zakotvena kozí protilátka vůči králičímu IgG. Do mikrotitračních destiček se
pipetuje testosteron ze vzorku, polyklonální králičí protilátka a testosteron
značený Eu3+ (inkubace 2 h, třepání, laboratorní teplota). Po
promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty.
Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je nepřímo úměrná koncentraci
testosteronu ve vzorku a měří se do 1 h. Rozsah metody na základě šestibodové
kalibrace je 0,4 – 65 nmol/l. Analytická citlivost je < 0,4 nmol/l.
Používání hemolytických, lipemických a ikterických sér se nedoporučuje. Při
reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.
Chemiluminiscenční
analýza v jednokrokovém uspořádání
používá monoklonální myší protilátku vůči testosteronu zakotvenou na
paramagnetických částicích, ke kterým se přidává standard nebo vzorek a
konjugát testosteronu značený akridiniumkarboxamidem. Po inkubaci a
promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok
hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině
testosteronu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm. Metoda dovoluje
měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,28 – 52
nmol/l (Vzorky s hodnotami testosteronu > 52 nmol/l lze manuálně ředit 4x;
po ředění musí být hodnota > 10,4 nmol/l). Preciznost v sérii je 1,9 –
4,0 %, celkově 3,1 – 8,0 %; zpětný výtěžek 97 – 111. Analytická senzitivita
0,28 nmol/l, funkční citlivost 0,49 nmol/l. Křížová reaktivita: 11-ketotestosteron 22,3 %, 11β-hydroxytestosteron 14,1 %, 6β-hydroxytestosteron 8,26 %,
19-nortestosteron 3,18 %, 19-hydroxytestosteron 2,2 %,
5α-dihydrotestosteron 2,11 %, androstendion 1,41 %, androsteron 1,04 %,
ostatní < 0,16 %. Neruší hemoglobin (1,5 g/l), bilirubin (342 µmol/l) ani
triacylglyceroly (22,6 mmol/l). Heterofilní
protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v
reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.
Podobný
kompetitivní princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu
jako značkou. Testosteron ze vzorku a testosteron značený esterem akridinu
spolu soutěží o vazebná místa polyklonální králičí protilátky vůči testosteronu
spojené s myší monoklonální protilátkou vůči
králičímu IgG, která je zakotvena na paramagnetických latexových částicích, na
které se během inkubace (5 min) připojí imunokomplex. Po odsátí roztoku a
promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří
vznikající luminiscenční záblesk
(intenzita signálu je nepřímo úměrná koncentraci testosteronu) fotonásobičem
při 429 nm. Vzorky s koncentrací testosteronu
> 52,1 nmol/l se ředí automaticky 5x (koncentrace > 260 nmol/l lze ředit
manuálně). Analytická citlivost je 0,35 nmol/l. Preciznost v sérii 2,3 – 6,2 %,
mezi sériemi 1,4 – 4,7 %. Linearita ředění je 94,8 – 115,3 %, zpětný výtěžek 83
– 107,5 %. Křížová reaktivita: 5α-dihydrotestosteron 5,4 %, ostatní < 1
%. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Při reakci mohou
interferovat heterofilní protilátky.
CLIA je
dvojstupňový kompetitivní zábleskový postup. Magnetické částice jsou potažené
protilátkou vůči testosteronu a testosteron ze vzorku se váže na její vazebná
místa. Imunoreakce probíhá 21 min, pak se přidá testosteron značený izoluminolem,
který obsadí zbylá vazebná místa protilátky. Imunoreakce probíhá 4 min, po
promytí se přidá startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a
fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině
testosteronu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0,17 – 52 nmol/l
(vyšší koncentrace testosteronu lze naředit). Analytická citlivost 0,11 nmol/l,
funkční citlivost 0,56 nmol/l. Preciznost v sérii 2,8 – 7,3 %, mezi
sériemi 7,1 – 14,0 %; zpětný výtěžek 90 – 105 %. Křížová reaktivita: 11-ketotestosteron
37,7 %, 11β-hydroxytestosteron 15,28 %, propionát
testosteronu 7,48 %, androstendion 4,27 %, nandrolon 3,33 %, ostatní ≤ 2,37 %. Hemolýza, bilirubin a
lipémie neruší. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.
Jiné stanovení je
založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Testosteron v prostředí
pufrovaného roztoku soutěží s testosteronem značeným ALP o vazebná místa
na polyklonální králičí protilátce imobilizované na polystyrenové kuličce.
Reakce probíhá 60 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu
odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje
luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná
koncentraci testosteronu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle
kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě
dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového
kódu činidla. Signál je nepřímo úměrný koncentraci testosteronu. Rozsah měření
je 0,7 - 55 nmol/l. Všechny vzorky, jejichž koncentrace by mohla být mimo
kalibrační rozmezí, je třeba naředit. Analytická citlivost 0,5 nmol/l.
Preciznost v sérii 5,1 – 16,3 % %, celková 7,2 % – 24,3 %; linearita
ředění 96 – 114 %, zpětný výtěžek 90 – 124 %. Křížová reaktivita: ≤ 2 %.
Neruší hemoglobin (2,7 g/l) a triacylglyceroly (5,6 mmol/l). Bilirubin výsledky
falešně zvyšuje. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky
se pipetuje standard nebo vzorek obsahující testosteron, myší monoklonální
protilátka vůči testosteronu, konjugát testosteronu s ALP a paramagnetické
částice potažené kozí polyklonální protilátkou vůči myšímu IgG. Po inkubaci
(imunokomplex se přichytí na magnetické částice přes kotvící protilátku) se
separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se
přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství
testosteronu. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,35
– 55,5 nmol/l. (po ředění 2x až do 111 nmol/l). Analytická citlivost 0,35
nmol/l. Preciznost v sérii 1,67 – 3,93 %, mezi sériemi 4,22 – 7,08 %.
Hemoglobin (10 g/l), bilirubin (171 µmol/l ani triacylglyceroly (20,3 mmol/l)
neruší. Křížová reaktivita 11-ketotestosteron 6,7 %,
11β-hydroxytestosteron 4,1 %, ostatní ≤ 1,6 %. Při reakci mohou
interferovat heterofilní protilátky.
Chemiluminiscenční
analýza v kompetitivním provedení, kdy testosteron ze vzorku soutěží
s testosteronem značeným křenovou peroxidázou o omezený počet
vazebných míst biotinylované myší protilátky. Imunokomplex se naváže na jamky
potažené streptavidinem. Po inkubaci (32 min) se promytím odstraní volný
materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož
oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo
pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného
světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je nepřímo
úměrný koncentraci testosteronu ve vzorku. Rozsah měření 0,17 – 75 nmol/l
(ředění se nedoporučuje). Analytická senzitivita 0,044 nmol/l, funkční
senzitivita 0,17 nmol/l. Preciznost v sérii 1,1 – 3,8 %, mezi sériemi je
2,4 – 7,4 %. Bilirubin výsledky zvyšuje až o 14 %, hemoglobin snižuje až o 13
%, lipémie neinterferují. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po
podání. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky. Křížová
reaktivita: 11-ketosteron 8,78 %, 11β-hydroxytestosteron 5,64 %,
19-nortestosteron 3,22 %, ostatní < 0,57 %.
Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)
v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován
s biotinylovanou monoklonální ovčí protilátkou vůči testosteronu a
2-bromestradiolem (uvolnění testosteronu z vazby na bílkoviny ve vzorku).
Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a konjugát
derivátu testosteronu s ruthéniovým komplexem a provede se druhá inkubace;
imunokomplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy.
Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí
magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí
tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci testosteronu ve vzorku.
Metoda je použitelná v rozsahu 0,087 – 52 nmol/l. Ředění není nutné. Analytická
citlivost 0,042 nmol/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,087 nmol/l.
Preciznost v sérii CV 1,2 – 14,8 %, mezi sériemi 2,5 – 18,1 %. Křížová reakce:
androstendion 2,5 %, ostatní < 1,0 %. Hemoglobin, chylozita, ikterus a RF
(< 1000 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj.
> 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání
biotinu. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu.
Plynová chromatografie s derivatizací na testosteron-17-chloracetát
s detektorem elektronového záchytu nebo derivatizace s anhydridem
heptafluoromáselné kyseliny jsou metody málo citlivé.
Byl sledován také poměr izotopů radioaktivního a derivatizovaného
steroidu (14C-testosteron + 3H-acetanhydrid +
thiosemikarbazid). Postup je pracný a nedává tak dobré výsledky, aby se mohl
použít pro referenční účely.
Kandidátní metoda je ID-LC-MS/MS (2013). Po dvou extrakcích ve
směsi etylacetát-hexan se testosteron stanovuje izotopovou dilucí
s kapalinovou chromatografií a sledování látek hmotnostní spektrometrem
po elektrospreji přechod m/z 289 → 97 a u izotopového analogu 313C-testosteronu
292 → 112. Preciznost v sérii je ≤ 1,5 %, mezi sériemi ≤
1,4 %. V roce 2007 byl již jiný návrh s použitím deuterovaného
testosteronu jako vnitřního standardu.
Certifikovaný referenční materiál nese označení NIST SRM971 a
z roku 2007 ERM-DA345a.
Toleranční limit EHK: 22 %.
Interference
Snížené hodnoty: cirhóza nebo insuficience jater, dlouhodobý klid na
lůžku, hladovění, malnutrice, menopauza, obezita, tělesná zátěž, termální
trauma, transplantace ledvin nebo srdce, stres, věk nad 40 let (muži);
aldakton, anabolika, androgeny, cyproteron, danazol, dexamethason,
dietylstilbesterol, digoxin, etanol, fenothiaziny, glukokortikoidy, glukóza,
halotan, interleukin-2, karbamazepin, ketokonazol, kortikosteroidy, metadon,
metoprolol, metyrapon, SHBG, slepota (muži), spironolakton, stanozolol,
steroidy, tetracykliny, verospiron, aj.
Zvýšené hodnoty: deficit 21-hydroxylázy, deficit 11-β-hydroxylázy,
EDTA, vyšší věk (ženy), luteální fáze menstruačního cyklu, poloha vstoje,
těhotenství; antikonvulziva, barbituráty, candida albicans v moči,
cimetidin, extrakt pepře nebo kopřiv, fenytoin, gonadotropiny (muži), chrysin,
klomifen, rifampin.
Další informace
Petr Štern, 2014-01-28