Stanovení volného trijodtyroninu
(fT3)
Synonyma
trijodthyronin free, FT3
3,5,3´- trijódtyronin
Preanalytická fáze
Při analýze se upřednostňuje sérum, lze použít
také plazmu (antikoagulans EDTA nebo heparin). Opakované zamrazení se nedoporučuje.
Možná vazba na separátorové gely. Zakalené vzorky je nutné před analýzou
odstředit.
Stabilita vzorku: T3 je dosti stabilní;
separace séra může být v krajním případě odložena o 48 h; nicméně se
doporučuje sérum zamrazit, pokud se neanalyzuje do 24 (48) h.
Stabilita v séru: 20 - 25 °C: 1 d, 4 - 8 °C: 14
dní, -20 °C: 3 měsíce. Biologický poločas 1,5 dne.
Hemolýza při analýze nevadí, ale je třeba se
vyhnout silné hemolýze, kdy by mohlo jejím vlivem docházet k naředění
vzorku.
Při RIA je třeba, aby nebyly pacientovi
podávány v rámci terapie radionuklidy po dobu 14 dnů.
Poznámky k analytické
metodě
Diskrepance mezi jednotlivými
metodami pro T3 jsou větší než pro T4, což je dáno jednak tím, že se stanovuje
nižší koncentrace, dále rozdílností v křížové reaktivitě u jednotlivých
antisér, rozdílnými interferencemi bílkovin a rozdíly v citlivosti metod.
RIA
je heterogenní postup, vyžadující oddělení volného a vázaného radioligandu.
Značkou je 125I. Nejvíce se využívá separace na pevné fázi, kdy je
analog T3 vázán na stěny zkumavky. Monoklonální protilátka vůči T3 značená 125I
je se vzorkem inkubována (2 h, laboratorní teplota, třepání) a dochází ke
kompetici mezi T3 ze vzorku a T3 ze stěn zkumavky o její vazebná místa. Pak se
obsah zkumavky odsaje a měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je
nepřímo úměrný koncentraci fT3. Rozsah metody je na základě pětibodové
kalibrace 0,5 – 44 pmol/l. Analytická citlivost je 0,5 pmol/l, funkční
citlivost 1,0 pmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV ≤ 6,4 %, mezi sériemi ≤ 5,5 %. Hemolytické, ikterické a lipemické vzorky
ruší stanovení. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.
Heterogenní enzymová
imunoanalýza ke stanovení T3 je v kompetitivním uspořádání a obvykle
používá jako značku křenovou peroxidázu. Mikrotitrační destičky jsou
potaženy protilátkou (polyklonální
králičí) vůči T3. Přidá se T3 ze séra a konjugát T3 s POD a inkubuje
se 60 min; jamky se vymyjí (3x) a přidá se substrát tetrametylbenzidin s H2O2.
Barevná reakce se po 15 min (ve tmě) zastaví 0,15 M H2SO4
a absorbance se měří při 450 nm (do 30 min) vertikálním fotometrem (sekundární
vlnová délka 600 – 650 nm). Celý postup se provádí za laboratorní teploty.
Absorbance je nepřímo úměrná koncentraci fT3 ve vzorku. Detekční limit metody
je 0,08 pmol/l. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je do 27,7 (61,6) pmol/l. Preciznost v sérii
dosahuje CV ≤ 4,94 %, mezi
sériemi ≤ 13,19 %. Silná
hemolýza a lipémie ruší. Reagencie je třeba skladovat při 2 – 8 °C.
Heterogenní fluorescenční imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) je technika, kdy se
celý imunochemický postup provádí na pevné fázi. Protilátka specifická vůči T3
je imobilizována na mikročásticích. Pak se přenese na matrici frity a přidá se
T3 značený ALP, který obsadí zbylá volná místa na protilátce. Po inkubaci se
provede promytí na fritě roztokem obsahujícím 4-metylumbeliferylfosfát
(fluorogenní substrát). Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a
současně se promývacím roztokem vymyje volný T3 z plochy, kde je měřena
fluorescence (plocha s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon
vytvořený ALP je fluorochrom. Intenzita fluorescence (excitace 485, emise 525 –
550 nm) je nepřímo úměrná koncentraci fT3 ve vzorku a je měřena fluorimetrem.
Detekční limit metody je 1,7 pmol/l. Rozsah měření na základě šestibodové
kalibrace je do 46 pmol/l. Preciznost v sérii dosahuje CV 2,53 – 7,86 %,
celkem 3,65 – 8,43 %. Hemoglobin, bilirubin a triacylglyceroly stanovení
neruší.
Fluorescence rozložená v čase (DELFIA) je heterogenní kompetitivní postup
s použití chelátů europia jako značky. Excitační světlo je 340 nm, emisní
pík europia 613 nm. Reakce probíhá v mikrotitračních destičkách. Do
mikrotitračních destiček se pipetuje vzorek a monoklonální myší protilátka vůči
europiu. Imunokomplex s monoklonální myší protilátkou vůči T3 je pak
zachycen pomocí druhé protilátky vůči myšímu IgG, kterou jsou potaženy stěny
jamek. Inkubace trvá 2 h za laboratorní teploty a třepání. Po promytí (4x) se
přidá T3-Eu3+ a inkubuje 30 min při 4 °C. Po promytí (6x) se přidá
zesilovací roztok, ionty europia jsou disociovány z vázané fáze a vytvoří
intenzivně fluoreskující chelát, jehož fluorescence je nepřímo úměrná množství
fT3 ve vzorku. Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,9 – 8,7 %, mezi sériemi
2,9 – 10,3 %. Analytická citlivost metody (±2 SD) je 1,5 pmol/l. Rozsah měření
do 60 pmol/l. Křížová reaktivita: kyselina 3,3´,5-trijodthyrooctová 103 %,
ostatní < 0,9 %.
Chemiluminiscenční
analýza v dvoukrokovém
uspořádání používá ovčí protilátku vůči T3 zakotvenou na paramagnetických
částicích, ke kterým se přidává standard nebo vzorek; po inkubaci a promytí
fosfátovým pufrem se přidá konjugát T3 značený akridiniumkarboxamidem a
dále 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá
chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině fT3 a sleduje se fotonásobičem při
429 nm. Metoda dovoluje měřit
vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 1,54 – 46 pmol/l.
Preciznost v sérii je 1,4 – 4,2 %, celkově 2,3 – 5,0 %. Analytická
senzitivita 1,54 pmol/l. Neruší hemoglobin (5 g/l), bilirubin (342 µmol/l) ani
triacylglyceroly (22,6 mmol/l).
Podobný princip zábleskové luminiscence s esterem
akridinu jako markerem je v sekvenčním uspořádání. T3 ze vzorku se
dělí s T3 analogem kovalentně navázaným na paramagnetické částice o
omezený počet vazebných míst na monoklonální myší protilátce označené esterem
akridinu. V první inkubaci (5 min, 37 °C) se váže T3 ze vzorku na
protilátku. Ve druhé inkubaci (2,5 min, 37 °C) jsou zbylá volná místa
protilátky obsazena T3 analogem s upevněnými paramagnetickými částicemi.
Pak jsou paramagnetické částice odděleny v magnetickém poli a promyty, aby
se odstranila volná protilátka s esterem akridinu a následně jsou částice
suspendovány v roztoku peroxidu vodíku a chemiluminiscenční reakce je
nastartována po nástřiku roztoku hydroxidu sodného do suspenze, čímž dochází
k oxidaci esteru akridinu a emisi luminiscence. Intenzita luminiscence
detekovaná luminometrem při 400 nm je nepřímo úměrná koncentraci T3 ve vzorku. Metoda
s dvoubodovou rekalibrací je použitelná do 30,8 pmol/l. Analytická senzitivita (±2 SD) je 0,3 pmol/l.
Preciznost v sérii CV 2,35 – 3,08 %, celkem 2,76 – 4,05 %. Křížová
reaktivita: dijodtyronin 1,47 %, ostatní < 1,0 %. Stanovení neruší
hemoglobin do 5 g/l, bilirubin do 342 µmol/l a triacylglyceroly do 11,3 mmol/l.
Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.
SPALT (Solid phase antigen linked
technique) je dvojstupňový sekvenční zábleskový postup. Magnetické částice jsou
potažené konjugátem proteinu a T3 a monoklonální protilátka je navázána na
derivát izoluminolu. Během první inkubace (10 min) se T3 ze vzorku
naváže na protilátku. Při druhé inkubaci (10 min) obsadí zbylá volná místa T3
navázaný na magnetické částice. Promytím se odstraní nevázaný materiál, přidá
se startér (0,12 % H2O2 + 4 % NaOH) a fotonásobičem se
měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině fT3. Rozsah měření na
základě dvoubodové kalibrace je 0,46 – 46 pmol/l. Analytická citlivost 0,46
pmol/l, funkční citlivost 1,54 pmol/l. Preciznost v sérii 1,4 – 4,7 %,
mezi sériemi 2,4 – 6,3 %. Stanovení
neruší hemoglobin do 10 g/l, bilirubin do 342 µmol/l a triacylglyceroly do 33,9
mmol/l. Extrémně vysoké koncentrace protilátek vůči ovčímu
imunoglobulinu mohou ovlivnit výsledky.
Jako značku lze použít také POD. Mikrotitrační
destičky jsou potaženy T3. V prvním kroku se přidá standard nebo vzorek a
ovčí protilátka značená křenovou peroxidázou. Proběhne kompetice (16 min) T3 ze
vzorku a T3 ze stěn jamek o vazebná místa na ovčí protilátce. Po vymytí
nenavázané frakce se přidá luminogen (derivát luminolu + sůl
peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů
(substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho
emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je nepřímo úměrný
koncentraci fT3 ve vzorku. Rozsah metody je
0,77 – 35 pmol/l (ředění vzorků se nedoporučuje). Analytická citlivost je 0,18
pmol/l, funkční citlivost 0,77 pmol/l. Preciznost v sérii CV 1,1 – 4,0 %,
celková 2,3 – 14,7 %. Zákal může ovlivnit výsledky testu. Interference mohou
způsobit protilátky vůči tyroidním hormonům a heterofilní protilátky. Stanovení
neruší hemoglobin do 5 g/l, bilirubin do 160 µmol/l a triacylglyceroly do 33,9
mmol/l.
Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do
zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující T3, monoklonální
protilátka vůči testosteronu konjugovaná s ALP. Během inkubace se naváže
fT3 na protilátku a pak se přidají paramagnetické částice potažené
streptavidinem a biotinylovaný analog T3. Po inkubaci (imunokomplex
s analogem T3 se přichytí na magnetické částice přes
biotin-streptavidinovou kotvu) se separací v magnetickém poli a promytím
odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované
světlo je nepřímo úměrné množství fT3. Rozsah měření při 470 nm na základě
šestibodové kalibrace je 1,4 – 46 pmol/l. Analytická citlivost 1,4 pmol/l.
Preciznost v sérii 2,6 – 6,6 %, mezi sériemi 1,3 – 8,0 %. Hemoglobin (10
g/l), bilirubin (342 µmol/l) ani triacylglyceroly (33,87 mmol/l) neruší.
Křížová reaktivita salicylan sodný 13,39 %, ibuprofen 17,2 %, acetaminofen -5
%, furosemid 15,9 %, karbamazepin 12,7 %, kyselina olejová 11,4 %, D-biotin
-7,3 %, ostatní ≤ 3,9 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní
protilátky.
Homogenní chemiluminiscenční
imunoanalýza
v sekvenčním uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI
zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální
biotinylované ovčí protilátky vůči T3. První reagencie (Chemibeads) je částice
potažena dijodtyroninem a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie
(Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo.
Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a v následující inkubaci
reagují Chemibeads a obsadí zbývající volná místa protilátky. Poté jsou přidány
reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy
obsahující obě částice (v případě, že se na protilátku vázala částice
Chemibeads). Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii
Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads
a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce
612 nm a je nepřímo úměrný hladině fT3 ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37
°C. Rozsah metody je na základě pětibodové kalibrace 0,8 – 46,2 pmol/l (nelze
ředit). Analytická citlivost je 3 pmol/l, funkční citlivost 0,8 pmol/l. Preciznost
v sérii 0,9 – 2,9 %, mezi sériemi 2,4 – 4,4 %. Interferují: diklofenak (38 %),
furosemid (57 %), ibuprofen (34 %), kyselina linolová (60 %), kyselina
mefanomová (49 %), kyselina olejová (42 %), fenylbutazon (15 %), fenytoin (17
%), kyselina salicylová (22 %), kyselina valproová (< 10 %). Hemoglobin
(10 g/l), bilirubin (342 µmol/l) ani triacylglyceroly (11,3 mmol/l) neruší.
Elektrochemiluminiscence
(ECLIA) následuje po imunoreakci na sekvenčním principu, kdy se vzorek (15 µl)
inkubuje s monoklonální ovčí protilátkou, značenou ruthéniovým komplexem a
v následné inkubaci se přidají biotinem značený T3 (obsadí zbývající volná
místa) a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem (vytvoří se vazba
biotin-streptavidin). Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se
paramagnetické mikročástice zachytí magnetem na povrchu elektrody. Nenavázané
látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na
elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se při 620 nm měří fotonásobičem.
Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci fT3 ve
vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,4 – 50 pmol/l (ředit nelze).
Analytická citlivost je 0,4 pmol/l, funkční citlivost 0,6 pmol/l. Preciznost
v sérii CV 1,1 – 6,5 %, mezi sériemi 1,6 – 8,2 %. Hemoglobin (10 g/l),
bilirubin (1128 µmol/l), RF (1200 kU/l) ani triacylglyceroly (22,6 mmol/l)
neruší. Vzorky
by neměly být odebrány pacientům podstupujícím léčbu s vysokými dávkami
biotinu (tj. > 5 mg/den) po dobu nejméně 8 hodin od podání poslední dávky
biotinu. Furosemid a Levothyroxin způsobují zvýšení naměřených hodnot i
v terapeutických dávkách. Ve vzácných případech je možné pozorovat
interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek proti test-specifickým
protilátkám, streptavidinu nebo rutheniu.
Izotopová diluce s GC/MS byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda
pro stanovení T3 v séru. Při tomto postupu se používá jako vnitřní
standard 13C9-T3. Před analýzou se provede odbílkování
vzorek, extrakce a purifikace HPLC. Přeměna sérového T4 na T3 je kontrolována
přídavkem 13C6-T4. T3 a 13C9-T3
byly přeměněny na N,O-diheptafluorbutyrylmetylesterové deriváty a monitorovány
při m/z
Izotopová diluce s LC/MS/MS elektrosprejí byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda
pro stanovení T3 v séru. Při tomto postupu se používá jako vnitřní
standard 13C9-T3. Před analýzou se provede odbílkování
vzorek, extrakce a purifikace HPLC. Přeměna sérového T4 na T3 je kontrolována
přídavkem 13C6-T4. Byly sledovány přechody m/z 652→606 pro T3 a 661→ 614 pro 13C9-T3. Při metodě neinterferují reverzní T3 a T4.
Rozsah metody 0,92 – 11,2 pmol/l. Detekční limit byl 18 pg. Výtěžnost 98,5 –
102,7 %. Preciznost dosahuje CV 0,9 – 1,2 %.
Certifikovaný referenční materiál pro T3 nese
označení IRMM-469 (Institute for Reference Materials and Measurements)
obsahoval 3,3´,5-trijódtyronin o čistotě 97,1 % s rozšířenou nejistotou
0,7 %.
Biologický poločas: 19 h.
Analytické požadavky (CLIA-88): Pro diagnostické
účely je vychýlení ±5,7 %, preciznost CV 11,5 %; pro terapeutické účely
vychýlení ±2,6 %, preciznost CV 5,2 %.
Toleranční limit EHK: 15 %.
Interference
Koncentrace T3 je v séru snížena: těhotenství 3.
trimestr, věk > 65 let, amiodaron, atenolol,
fenytoin, heparin, kyselina valproová, metoprolol, propranolol, aj.
Koncentrace T3 je v séru zvýšena: cvičení, menopausa,
nadmořská výška, volné mastné kyseliny, tepelný stres, alprenolol, amiodaron,
D-tyroxin, perorální kontraceptiva, propranolol, aj.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28