Stanovení vitaminu D
Synonyma
Pod tímto názvem se podle IUPAC rozumí vitamin především
vitamin D3, tj. kalciol neboli cholekalciferol.
Do třídy vitaminů D uvádí IUPAC (jako semisystematické) ještě
tyto názvy: kalcidiol (25-hydroxycholekalciferol), kalcitriol
(1α,25-dihydroxycholekalciferol), erkalciol neboli ergokalciferol,
erkalcitriol (1α,25-dihydroxyergokalciferol), (24S)-metylkalciol
neboli 22,23-dihydroerkalciol (22,23-dihydroergokalciferol), kalcitetrol
(1α,24R,25-trihydroxycholekalciferol), (6Z)-takalciol
(provitamin D3),
takalciol (tachysterol3), (5E)-isokalciol (izovitamin
D3), dihydroerkalciol
(dihydrotachysterol3).
Další synonyma: 1,25-DHCC,
1,25-dihydroxy-22-ovavitamin D(3), 1,25-dihydroxycholecalciferol,
1,25-dihydroxy-vitamin-D, 1,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25-diOHC, 1,25(OH) 2D3,
1-alpha (OH) D3, 19-nor-1, 1-alpha-hydroxycholecalciferol,
1-alpha-hydroxyvitamin D2, 1-hydroxyvitamin D, 22-oxacalcitriol (OCT),
24,25(2OH)vitamin D(3), 25 hydroxyvitamin D (25(OH)D), 25-dihydroxyvitamin D2,
25-dihydroxyvitamin D2, 19-nor-1, 25-HCC, 25-hydroxycholecalciferol,
25-hydroxyvitamin D, 25-hydroxyvitamin D3, 25-OHCC, 25-OHD3, activated
7-dehydrocholesterol, activated ergosterol, alfacalcidol, calcifediol,
calcipotriene, calcipotriol, calcitriol, cholecalciferol, colecalciferol,
dichysterol, dihydrotachysterol, dihydrotachysterol 2, doxercalciferol,
ecocalcidiol, ED-21 (vitamin D analog), ED-71 (vitamin D analog),
ergocalciferol, ergocalciferolum, falecalcitrol,
hexafluoro-1,25dihydroxyvitamin D3, irradiated ergosterol, maxacalcitol, MC903,
paracalcin, paricalcitol, tacalcitol, viosterol.
Preanalytická fáze
Stanovuje se v plazmě (antikoagulans heparin, resp.
EDTA) nebo séru. Odběr ráno nalačno. Krev chránit před světlem a dopravovat na
ledu. Stabilita D3 při 4 – 8 °C 3 d, při -20 °C 1 rok. Vzorek lze
opakovaně rozmrazit.
Poznámky k analytické
metodě
Stanovení 25-hydroxyvitaminu D
Kompetitivní vazebná analýza se specifickým vazebným
proteinem: vzorek a 3H-25-hydroxyvitamin D soutěží o vazebná
místa na vitamin D-vazebném proteinu. Při stanovení ruší mastné kyseliny, které
nelze zcela oddělit. Subnormální hladiny se stanovují obtížně a vyžaduje se
beta-počítač.
RIA měří sumární koncentraci vitaminu D2 a
D3. Po imunoprecipitaci a extrakci se extrakt pipetuje do
polystyrenových zkumavek potažených protilátkou vůči stanovovaným analytům. O
vazebná místa soutěží analyty ze vzorku a analyty značené 125I. Po
inkubaci (110 min, laboratorní teplota) se roztok odsaje, promyje a měří se
signál gama-počítačem. Sedmibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu
3,25 – 420 nmol/l, citlivost metody je 3,25 µg/l. Preciznost v sérii je
< 7 %, mezi sériemi < 9 %. Výsledky jsou k dispozici za 3 h od
začátku analýzy.
ELISA na mikrotitračních destičkách
v kompetitivním uspořádání má rozsah 14,75 – 300 nmol/l a celkovou dobu
provedení < 2,5 h. Celková preciznost je < 10 %.
Jiná metoda je podrobněji
popsaná. Kompetice o monoklonální protilátku vůči 25-hydroxyvitaminu D,
zakotvenou v jamkách mikrotitračních destiček, probíhá mezi analytem ze
vzorku a analytem značeným biotinem. Po inkubaci (2 h) se nenavázaný
materiál odstraní trojnásobným promytím. Přidá se streptavidin značený POD a po
další inkubaci (30 min) a trojnásobném promytí chromogen
tetrametylbenzidin s peroxidem vodíku a reakce probíhající ve tmě 15 min
(třepání) je zastavena stop činidlem (0,5 M H2SO4).
Měření bichromaticky při 450 nm nutno provést do 30 min (proti 620 – 650 nm).
Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Rozsah měření na základě
šestibodové kalibrace je 4 – 300 nmol/l (při vyšších koncentracích se provádí
ředění 2x). Preciznost v sérii je 3,2 – 4,9 %, mezi sériemi 7,0 – 8,6 %.
Linearita ředění 99 – 115 %.
Stanovení neruší hemoglobin do 10 g/l, triacylglyceroly do 22,6 mmol/l a
bilirubin do 342 µmol/l.
Lze také získat soupravu
stanovující pouze 25-hydroxyvitamin D3 (pomocí monoklonální
protilátky), která má rozsah 0(?) – 500 nmol/l, celkovou dobu provedení 1 h a
celkovou preciznost < 10 %. Toto stanovení lze provést i z celé krve.
Homogenní enzymová
imunoanalýza s vazbou
na vitamin D vazebný protein. Rozsah metody je 12,5 – 312,5 nmol/l. Provedení
je kratší než 2 h. Preciznost v sérii i mezi sériemi je < 10 %.
Chemiluminiscenční
imunoanalýza
v kompetitivním uspořádání probíhá v jednom reakčním stupni. Po
pipetování vzorku se přidá analog vitaminu D konjugovaný s fluoresceinem
v pufru a roztok se inkubuje při 37 °C 4,5 min, dále se přidá monoklonální myší protilátka vůči vitaminu D značená esterem akridinu. Roztok se inkubuje při 37 °C
5,5 min, přidají se paramagnetické latexové
částice potažené myší monoklonální protilátkou proti fluoresceinu spolu
s analogem vitaminu D konjugovaným s fluoresceinem. Opět se inkubuje
při 37 °C 2,75 min. Po
odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned
se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm, který je nepřímo úměrný
koncentraci 25-hydroxyvitaminu D. Rozsah metody je 9,25 – 375 nmol/l. Vzorky s koncentrací
vitaminu D > 375 nmol/l se ředí manuálně 2x. Stanovení vykazuje vysokou specificitu pro
25-hydroxyvitamin D2 a 25-hydroxyvitamin D3. Limit blanku
byl 4 nmol/l, mez detekce 8 nmol/l, mez kvantitativního stanovení 8,8 nmol/l, funkční citlivost 8,3 nmol/l. Preciznost
v sérii 2,7 – 7,0 %, celková 4,8 – 11,1 %. Zpětný výtěžek byl 83,3 – 100,2 %. Neruší hemolýza do 15,5 g/l
hemoglobinu, triacylglyceroly do 4,07 mmol/l a bilirubin do 684 µmol/l.
CLIA
je kompetitivní chemiluminiscenční analýza ke stanovení 25-hydroxyvitaminu D
v séru. Při inkubaci (10 min) se analyt ve fosfátovém pufru uvolní
z vazebného proteinu a váže se na specifickou protilátku zakotvenou na
magnetických částicích. Pak se přidá vitamin D značený izoluminolem. Po další
inkubaci (10 min) se nevázaný materiál odstraní promytím. Pak se přidá startovací
činidlo (4 % NaOH + 0,12 % H2O2) a fotonásobičem se
sleduje luminiscence, která je nepřímo úměrná koncentraci analytu. Rozsah
metody je 10 – 375 nmol/l, vyšší koncentrace se ředí manuálně 5x. Interference
dihydroxyvitaminů jsou vysoké (D3 17 %, D2 40 %).
Hemolýza, chylozita a ikterus neruší. Preciznost v sérii byla 5,2 – 8,1 %,
mezi sériemi 6,9 – 12,7 %. Zpětný výtěžek byl 97 – 111 %.
Stanovení
elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním
uspořádání trvá 27 min. Inkubací
vzorku (15 µl) s přípravnou reagencií (roztok dithiothreitolu a hydroxidu
sodného) je vázaný vitamin D (25-OH) uvolněn z vitaminu D vážícího proteinu.
Inkubací předpřipraveného vzorku ruthéniem značeného vitamin D vážícího
proteinu vznikne komplex mezi vitaminem D (25-OH) a vitamin D vážícím proteinem
značeným rutheniem. Po přidání streptavidinem potažených paramagnetických
mikročástic a vitaminu D (25-OH), značeného biotinem, dojde při další inkubaci
k obsazení volných ruthéniem značených vitamin D vážících proteinů. Vznikne
komplex skládající se z rutheniem značeného vitamin D vážícího proteinu a
biotinylovaného vitaminu D (25-OH), který se naváže na pevnou fázi interakcí
biotinu a streptavidinu. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde
se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se
odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci 25-hydroxyvitaminu D ve
vzorku. Při hemolýze (> 2 g/l hemoglobinu) jsou výsledky falešně vyšší.
Chylozita a ikterus neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj.
> 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního
podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 7,5 – 175 nmol/l. Limit blanku byl 5
nmol/l, mez detekce 7,5 nmol/l, mez kvantitativního stanovení 12,5 nmol/l (CV
celková ≤
30 %), funkční
citlivost 10 nmol/l (CV
mezi sériemi ≤
20 %).
Preciznost v sérii CV 2,7 – 7,8 %, mezi sériemi 3,7 – 10,7 %. Protilátky vůči streptavidinu
a rutheniu mohou interferovat.
HPLC měří současně koncentraci vitaminu D2
a D3. Provádí se extrakce do éteru nebo acetonitrilu a izokratické
dělení na koloně (SiO2 125 mm) na normální fázi (n-hexan) při 30 °C
a fotometrická detekce při 254 nebo 265 nm. Detekční limit metody je 2,48 µg/l.
Preciznost pro 25-hydroxyvitamin D3/D2 v sérii
4,58/9,07 % mezi sériemi 5,08/8,39 %, zpětný výtěžek 94,8/96,6 %, linearita
ředění umožňuje stanovení až do 500 µg/l.
LC-MS/MS probíhá na reverzní fázi C18
v gradientovém uspořádání s MS elektrosprejí. Citlivost je extrémně
vysoká (rozsah měření 0,05 – 2,5 nmol/l).
K dispozici jsou standardy NIST pro 25-hydroxyvitamin D2
a D3 z roku 2010 a to SRM 972 (4 materiály v normálním
rozmezí) a SRM 2972 (2 materiály s vysokou koncentrací).
Toleranční limit EHK: 33 %.
Stanovení 1,25-dihydroxyvitaminu D
Radioreceptorová analýza používá telecí tymus, který
se jeví nejvýhodnější a váže jak D2, tak D3. Detekční
limit metody je 4,8 – 12 pmol/l.
RIA měří sumární koncentraci vitaminu D2 a
D3. Může se také používat
kompetice se značkou 3H nebo 125I. Polystyrenové
zkumavky jsou potažené protilátkou vůči stanovovaným analytům. O vazebná místa
soutěží analyty ze vzorku a analyty značené 125I. Po inkubaci přes
noc se roztok odsaje, promyje a měří se signál gama-počítačem. Rozsah měření je
11,3 – 986 pmol/l, citlivost metody je 3,84 pmol/l.
Interference
Hodnoty snížené: fenobarbital, fenytoin, glukokortikoidy,
cholesterylamin, izoniazid, izotretinoin, karbamazepin, ketokonazol,
kolestipol, primidon, rifampicin. Dále: celiakie, cholestatická játra, deficit
slunečního světla, osteomalacie, pseudohypoparatyreóza, rachitida, nefrotický
syndrom a jiné.
Hodnoty zvýšené: estrogeny, oktreotid, prednison. Dále:
hyperparatyreóza, laktace, nadměrný příjem vitaminu D, sarkoidóza, těhotenství,
po cvičení a jiné.
Další
informace
Petr
Štern, 2014-01-28