Stanovení cholinesteráz (CHS)

Stanovení cholinesteráz

 

Synonyma

acylcholin acylhydrolasa, EC 3.1.1.8; stanovuje se v séru
pseudocholinesteráza; pseudocholinesterasa; cholinesterasa;  nespecifická cholinesterasa; cholinesterasa II (nespecifická);
BtChoEase; butyrylcholinesterasa; butyrylcholin esterasa;
propionylcholinesterasa;
benzoylcholinesterasa;
anticholinesterasa;

acetylcholin acetylhydrolasa, EC 3.1.1.7; nestanovuje se v séru
pravá cholinesteráza; pravá cholinesterasa; cholinesterasa; cholinesterasa I;
AcCholE; acetylcholinesterasa; acetyltiocholinesterasa; acetyl-β-metylcholinesterasa;
acetylcholinhydrolasa.

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. V anglickém názvosloví EC je kmenový základ někdy (např. butyrylcholinesterase) spojený s názvem přenášené skupiny, jindy ale (např. butyrylcholine esterase) může být samostatně. Mezinárodně uznávaná zkratka enzymu 3.1.1.8 neexistuje, ale běžně se používá označení ChE (Google 50 400), případně BChE (Google 59 400). Pro enzym 3.1.1.7 se používá zkratka AChE (Google 76 100), ale mezinárodně uznávaná zkratka rovněž není.

 

Preanalytická fáze

Náběr do skla nebo plastu, jako protisrážlivý prostředek se používá EDTA nebo heparin. Po náběru okamžitě centrifugovat a separovat. Stabilita: 8 hodin při 20 - 25 °C, 1 týden při 4 - 8 °C, 1 rok při -20 °C. Při podezření na intoxikaci organofosfáty vzorek po odběru transportovat v ledové tříšti. Vzorky u kterých se předpokládá, že by mohly obsahovat reverzibilní inhibitor je třeba transportovat a skladovat na ledu a analyzovat co nejdříve, abychom zabránili destrukci enzymu inhibitorem in vitro. Doba inkubace po naředění vzorku činidlem by měla být co nejkratší, abychom omezili reaktivaci enzymu během analýzy.

Hemolýza zvyšuje hodnoty pokud je použit jako substrát acetylcholin (současně s plazmatickou cholinesterázou je stanovena acetylcholinesteráza přítomná původně v erytrocytech); při použití butyrylthiocholinového substrátu hemolýza nevadí. Mírná hemolýza neruší, jestliže je sérum dobře odstředěno, aby se odstranily erytrocyty. Lipémie nebo ikterus (bilirubin do 340 µmol/l) při stanovení neruší. Přítomnost oxalátů, fluoridů nebo citranů významně snižuje aktivitu cholinesterázy.

Doporučuje se používat skleněné nádobky na reagencie, protože z některých plastových nádobek se mohou extrahovat inhibitory reakce.

Výsledky analýzy závisí také na věku a pohlaví pacienta a používání kontraceptiv. V těhotenství jsou přibližně o 30 % nižší.

 

Pokud se provádí kvalitativní stanovení v plodové vodě (elektroforéza) je třeba vzorky před analýzou skladovat při –70° C.

 

Popis metody

Pseudocholinesteráza (ChE) 3.1.1.8 katalyzuje hydrolytické štěpení různých esterů cholinu. Poločas vymizení: 11 dní.

Je známo nejméně 13 izoenzymů, které se ale separátně nestanovují a jejich význam není dostatečně objasněn.

 

Doporučená metoda:

 

 

        propionylthiocholin                                           propionát                  thiocholin

 

  thiocholin          DNTB = Ellmanovo činidlo       smíšený disulfid        5-merkapto-2-nitro-

                    5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina)                                benzoová kyselina

 

Tato dvoustupňová metoda může být prováděna v E.P. nebo kinetickém režimu. Reakce probíhá ve fosfátovém pufru při pH 7,6 a žluté zbarvení smíšeného disulfidu se sleduje při 410 nm.

 

Činidla:

1.    Fosfátový pufr, 0,036 mol/l, pH 7,6. Připraví se roztok 0,036 mol/l Na₂HPO₄ rozpuštěním 4,73 g této soli v přibližně 800 ml destilované vody, která se pak doplnění na 1 litr. Připraví se roztok 0,1 mol/l KH₂PO₄ rozpuštěním 13,6 g této soli v destilované vodě tak, aby konečný objem roztoku byl 1 litr. Smícháním 50 ml roztoku KH₂PO₄ s 950 ml roztoku Na₂HPO₄ se dosáhne výsledné hodnoty pH 7,6. Fosfátový pufr je stabilní 3 měsíce při 4 až 8 °C, ale musí se každý týden kontrolovat, zda nedošlo k bakteriální kontaminaci nebo změně pH.

2.    Roztok propionylthiocholin jodidu (PCTI), 20 mmol/l. 606 mg PCTI se vloží do 100 ml odměrné baňky a rozpustí v přibližně 80 ml destilované vody, poté se doplní na 100 ml destilovanou vodou. Roztok je stabilní 1 den za laboratorní teploty.

3.    5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina) (DTNB), 0,421 mmol/l. Naváží se 167 mg DTNB, rozpustí se v 0,036 mol/l fosfátového pufru a pufrem doplní do 1 litru. Roztok je stabilní 12 měsíců, je-li skladován v tmavé láhvi při 4 °C.

4.    Chinidin sulfát, 14 mmol/l. Naváží se 500 mg chinidin sulfátu a rozpustí v přibližně 90 ml destilované vody a poté doplní na konečný objem 100 ml. Roztok je stabilní 1 rok za laboratorní teploty.

5.    Pracovní činidlo PCTI. Připraví se 3 ml roztoku pro každý vzorek naředěním PCTI stejným množstvím destilované vody.

 

Přístrojové vybavení: spektrofotometr nebo fotometr nastavitelný na 410 nm se šířkou pásma < 10 nm a kyvetou temperovanou na 37 °C.

           

Stanovení celkové aktivity:

1.    Připraví se dvě zkumavky pro každý vzorek nebo kontrolu (označí se jako test, resp. blank).

2.    Do každé zkumavky se přidají 3 ml DTNB pufru a zkumavky se inkubují 5 min při 37 °C.

3.    Přidá se 1 ml pracovního činidla PCTI do zkumavek označených jako test.

4.    Přidá se 1 ml séra ředěného 1:100 (vzorky s nízkou aktivitou musí být znovu analyzovány a ředěny 10-krát nebo 50-krát). Ředění séra je třeba provádět bezprostředně před analýzou, protože ChE po ředění zvolna ztrácí aktivitu.

5.    Přesně po 3 min se přidá chinidinové činidlo, které zastaví reakci.

6.    Sérové blanky se připraví opakováním kroků 2 a 5 v opačném pořadí, tj. napřed se přidá chinidinové činidlo, pak sérum a nakonec DTNB pufr.

7.    Absorbanci každého testu vůči příslušnému blanku je třeba změřit do 5 min.                 

 

Thiocholin také mění 4,4´-dithiopyridin na merkaptopyridin a ten je okamžitě

tautomerizován na thiopyridin absorbující při 344 nm :

 

 

Další metoda je rovněž komerčně dostupná, avšak štěpení acetylcholinu má mnohem větší mezilaboratorní variabilitu výsledků:

 

 

          acetylcholin                                                 acetát                         cholin

 

Vznik cholinu je provázen změnou pH, která se může sledovat pH elektrodou, fotometricky (vytvoření barevného komplexu s cholinem) nebo titrací roztokem NaOH na fenolovou červeň.

 

Další používaný substrát je umělý a to benzoylthiocholin. Kinetická metoda sleduje při 260 nm vznik kyseliny benzoové. Postup je rychlý a přesný, ale náročný na optiku a čistotu chemikálií.

 

 

 

 

            benzoylthiocholin                                             thiocholin            kyselina benzoová

 

 

 

Poznámky k analytické metodě

Nejvíce se používají spektrofotometrické metody s propionylthiocholinem nebo acetyl-thiocholinem jako substráty. Uvolněný thiocholin se váže na 5,5'-dithiobis(2-nitro-benzoovou kyselinu) (DTNB) a žlutý adukt se měří E.P. nebo kinetiky při 410 nm. Celková doba analýzy je 10 min. Je-li použit propionylthiocholin jodid jako substrát, je nižší činidlový blank a aktivita při 37 °C o 27% vyšší, než v případě butyrylthiocholin jodidu. Uvádí se také lepší rozlišení mezi jednotlivými fenotypy cholinesterázy a reprodukovatelnost mezi sériemi 3 %.

Titrační metody sledují protony uvolněné z acetylcholinu: buď pomocí změny pH (60 – 90 min !) nebo změnou zbarvení fenolové červeně (30 min !). Elektrometrická titrace může být automatizovaná, kdy se k uvolňovaným protonům kontinuálně přidává báze, která je neutralizuje. Přístroj udržuje konstantní pH a spotřeba báze je přímo úměrná množství hydrolyzovaného acetylcholinu. Automatizované stanovení je rychlé (kinetická varianta) a CV je 4 – 5 %. Titrační metody jsou velmi citlivé na dodržování teploty a pH.

Pokud se použije benzoylthiocholin jako substrát, je potřebné vybavení spektrofotometrem schopným měřit ve střední UV oblasti (260 nm).

Certifikovaný referenční materiál není zatím dostupný. Toleranční limit EHK: 21 %.

 

V plodové vodě se sleduje pravá cholinesteráza EC 3.1.1.7 kvalitativně nebo kvantitativně s využitím inhibitoru 1,5-bis(4-allyldimetylamoniumfenyl)pentan-3-on dibromidu (BW 284C51).  Kvalitativní důkaz lze provést elektroforézou v polyakrylamidovém gelu, kdy se rozdělí jednotlivé izoenzymy (v přítomnosti inhibitoru se pás izoenzymu EC 3.1.1.7. neobjeví).

 

 

Významné interference

Aktivita pseudocholinesterázy může být snížená u pacientů při podávání estrogenů nebo vlivem orálních kontraceptiv, awelysinu nebo cyklofosfamidu.
Aktivitu pseudocholinesterázy zvyšuje: etanol.

 

 

Další informace

Principy analytických postupů

Postupy pro hodnocení aktivit enzymů

Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů

 

 

 

Petr Štern, 2010-03-10