Stanovení
aktivity γ-glutamyltransferázy
Synonyma
(5-L-glutamyl)-peptid:aminokyselina 5-glutamyltransferasa, EC 2.3.2.2;
GGT; γ-GT; L-glutamyltransferasa; L-γ-glutamyltransferasa;
γ-GPT;
γ-glutamylpeptidyltransferasa;
γ-GTP;
glutamyltranspeptidasa; α-glutamyltranspeptidasa; γ-glutamyltranspeptidasa; γ-glutamyltranspeptidasa; L-γ-glutamyltranspeptidasa.
Chemické
názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada
současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Prof. Kodíček uvádí celý
název jako jedno slovo, v anglickém názvosloví EC je kmenový základ někdy
(např. transferase) spojený s názvem přenášené skupiny, jindy ale (např.
transpeptidase) může být samostatně.
Preanalytická fáze
Stabilita 20 až 25 °C 3 dny (sérum), 3 dny (plazma – nepoužívat jiné
antikoagulans než heparinát lithný), 4 až 8 °C 7 dní, –20 °C alespoň 2 měsíce. Nicméně EDTA při stanovení v plazmě neruší,
protože doporučená metoda nepoužívá hořečnaté ionty, které by mohly být
maskovány uvedeným chelátem. Stanovení ruší fluorid sodný, oxalát a citran,
které při koncentraci 1 g/l inhibují aktivitu GGT přibližně o 15 %. Také
lipémie a ikterus mohou aktivitu GGT snižovat.
Jedinci s nadváhou ≥ 30 % vykazují zvýšenou katalytickou koncentraci GGT.
Ruší silná hemolýza. Slabá hemolýza nezpůsobuje znatelnou změnu měřené aktivity GGT.
Popis metody
γ-Glutamyltransferáza,
EC 2.3.2.2
katalyzuje přenos γ-glutamylové skupiny z peptidů (glutation) na jiné
peptidy nebo L-aminokyseliny (vnější
transpeptidace), jiné molekuly substrátu (vnitřní transpeptidace) nebo vody
(hydrolýza).
Poločas vymizení: 4,1 dne.
Je známo nejméně 11 izoenzymů, které
se ale separátně nestanovují a jejich význam není dostatečně objasněn.
L-γ-glutamyl- glycylglycin 3-karboxy- glutamyl-
3-karboxy-4-nitroanilid 4-nitroanilin glycylglycin
Doporučená metoda IRMM/IFCC – 452 používá
karboxylovaný substrát, který je mnohem rozpustnější než původně navržený
L-γ-glutamyl-4-nitroanilid. Karboxylovaný
substrát je možné nechat samovolně hydrolyzovat i bez přítomnosti peptidu.
Vzniká stejný barevný produkt (3-karboxy-4-nitroanilin) a kyselina glutamová.
Původní metoda (substrát
L-γ-glutamyl-4-nitroanilid) měla dvě verze dle doporučení Americké resp.
Skandinávské společnosti klinické chemie. Metody se lišily použitým pufrem
(2-amino-2-metylpropan-1,3-diol, resp. Tris-HCl), pracovním pH (8,6, resp. 7,6)
a koncentrací glycylglycinu (50, resp. 75 mmol/l). Vedle použití 4-nitroanilidu
je také popsáno stanovení GGT ve fosfátovém pufru s α-naftylaminem jako
substrátem. Fotometrická detekce se provádí kineticky při 405 až 420 nm.
Fluorimetrické stanovení
v tris(hydroxymetyl)aminometanovém pufru (optimální pH 8,2) s
hydrochloridem dimetylesteru kyseliny
N-γ-L-glutamyl-5-aminoizoftalové nebo γ-L-glutamyl-α-naftylamidem jako substrátem. První
uvedený substrát je lépe rozpustný a reakce je 10x citlivější. Používaná
excitační vlnová délka je 335 nm, emitované záření 435 nm.
Doporučená metoda A
donor skupiny:
(γ-glutamyl)-3-karboxy-4-nitroanilid
8,4 mmol/l
akceptor skupiny: glycylglycin 190
mmol/l
pufr: Tris-HCl: 100 mmol/l (pH 8,16)
poměr vzorku a činidla: 1+10,
vlnová délka měření: 410 nm
(interferuje silná hemolýza)
Roztok substrátu v pufru:
Tris (100 mmol/l),
glycylglycin (190 mmol/l),
(γ-L-glutamyl)-3-karboxy-4-nitroanilid
(8,4 mmol/l),
Navážky jsou přidány do přibližně 800
ml destilované vody. Pomocí HCl 1 mol/l je nastaveno pH na
Přístrojové vybavení: spektrofotometr
se šíří spektrálního pásu 10 nm, umožňující měření při 410 nm s teplotně
stabilizovanou kyvetou (možnost analogového zápisu se doporučuje).
1. Do 3 ml kyvety dávkovat 2 ml roztoku substrátu v
pufru a 0,20 ml séra nebo plazmy.
2. Smíchat a nechat stát 1 min.
3. Sledovat změnu absorbance 5 min při 410 nm.
Není-li k dispozici zapisovač, sledovat hodnotu každých 20 s.
Když molární absorptivita (ε)
2-nitro-5-aminobenzoové kyseliny
(tj.3-karboxy-4-nitroanilinu) je 9500 l/cm.mol, lze vypočítat aktivitu enzymu
při délce optické dráhy 10 mm:
µkat/l = ΔA/min
x celkový objem/objem
vzorku x 1/ ε
x 106 µmol/mol x
1/60
jmenovitě:
ΔA/min
x 2,2/0,2 x 1/9500
(l/mol.cm) x 106 x
1/60 = ΔA/min x 3,86
Doporučená metoda B
Složení reakční směsi:
Glycylglycin 150 mmol/l
pH (37°C) 7,7 ± 0,05
L-g-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid 6 mmol/l
Objemový poměr vzorku
0,0909 (odpovídá poměru vzorku a reakční směsi 1:11)
Reagenční roztok:
V přibližně 80 ml destilované vody se rozpustí 2,73 g (206,3 mmol/l) glycylglycinu a pomocí roztoku NaOH 2 mol/l se pH při 37 °C nastaví na 7,7.
Startovací činidlo:
V přibližně 15 ml destilované vody se rozpustí 0,229 g (33,0 mmol/l)
vodného roztoku L-g-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidu
(amonné soli, monohydrátu). Po přelití do 20 ml odměrné baňky se
roztok ekvilibruje na 20 °C a doplní destilovanou vodou po kalibrační rysku.
Takto připravený roztok je stabilní 1 týden při 2 – 8 °C.
Podmínky měření
Teplota
37°C ±
Vlnová délka 410 nm (±1 nm)
Šíře spektrálního pásu (pološířka spektrálního pásu) ≤ 2 nm
Délka optické dráhy (tloušťka kyvety)
Doba inkubace 180 s
Délka prodlevy (doba od startu do počátku měření) 60 s
Interval měření 180 s
Počet měřících bodů
> 6
Postup měření:
2,000 ml reagenčního roztoku se vytemperuje na 37°C. Přidá se 0,250 ml vzorku a po důkladném promíchání následuje inkubace
180 s při 37°C. Po přidání 0,500 ml startovacího činidla a důkladném promíchání následuje prodleva
90 s pak měření absorbance po dobu 180 s.
Poznámka: Ekvilibrujte pouze odpovídající objem (~0,8 ml) startovacího činidla. Zbývající objem startovacího činidla by měl být skladován při 2 – 8 °C. Protože je také poměrně velká spotřeba vzorku je třeba také ekvilibrovat na teplotu 37 °C adekvátní množství séra.
Reagenční
blank:
Vzorek biologického materiálu je nahrazen stejným objemem 9 g/l (154 mmol/l)
NaCl. Hodnota ΔA/min nesmí přesáhnout 0,002/min
(doporučení IFCC 0,001/min). Slouží ke korekci hodnoty ΔA/min
měřeného vzorku.
Blank vzorku:
Startovací činidlo je nahrazeno 9 g/l (154 mmol/l) NaCl. Používá se jen ke
kontrole vhodnosti kalibrátorů a kontrolních materiálů s tím, že jeho
hodnota musí být < 1 % hodnoty naměřené katalytické
koncentrace GGT ve vzorku.
Horní hranice pracovního rozsahu (vyšší mez stanovitelnosti): ΔA/min = 0,2
Způsob ředění při překročení horní hranice (odpovídá
přibližně 4,5 µkat/l):
Vzorek musí být naředěn 154 mmol/l NaCl a analýza opakována.
Výpočet:
ΔA/min (po korekci na reagenční blank) x F = GGT ve zvolených jednotkách
(kde faktor F = 22,538 je pro výpočet v µkat/l; odvozeno z hodnoty e410 = 796 m2/mol pro 5-amino-2-nitrobenzoát).
Intraindividuální biologická variace 15 %, teoretický toleranční limit 22 %. Toleranční limit EHK: 20 %.
Poznámky k analytické
metodě
Nečistoty ze syntézy L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidu (přípustná kontaminace je 0,5 %) nebo glycylglycinu (přípustná kontaminace je 0,1 %) mohou inhibovat analytické stanovení katalytické koncentrace GGT. Nekarboxylovaný substrát je sice o 19 % citlivější než karboxylovaný, ale vzhledem ke své omezené rozpustnosti je nutné používat přesycený roztok, který je stabilní jen po několik hodin. Dobře rozpustný L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid nepodléhá hydrolýze. Při jeho koncentraci 10 až 12 mmol/l nedochází k inhibici enzymové reakce. Používané substráty jsou bezbarvé a sleduje se vzrůst absorbance po odbourání glutamylové skupiny pomocí GGT.
Maximální aktivity GGT je dosaženo za těchto podmínek: pH 7,8 až 8,5; glycylglycin 129 až 250 mmol/l; γ-L-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid 6,6 až 10,2 mmol/l; poměr sérum-činidlo 1:11; pufr Tris-HCl 100 mmol/l.
Při použití delší vlnové délky měření ( > 410 nm) se snižuje absorbance blanku.
Doporučená metoda ať už v jednočinidlové (A) nebo dvoučinidlové (B) variantě je v plném rozsahu obtížně aplikovatelná zvláště u rychlých analyzátorů s velmi malým měřícím objemem. Současné citlivé analyzátory dovolují zkrátit měření ze 3 min na 1 min a tím zkrátit celkový čas na 5,5 min, což je akceptovatelné i pro rychlé analyzátory.
Doporučená délka optické dráhy kyvetou je
Poměr vzorku a
reakční směsi 1:11, takže použijete-li sumárně 150 µl činidel je třeba dávkovat
15 µl vzorku. Doporučená metoda IFCC uvádí jako vzorek pouze sérum. Linearita
metody je za těchto podmínek přibližně do 4,5 µkat/l.
Extrémně levné soupravy
indikují nekvalitní γ-L-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid. Specifickým inhibitorem je fluorid sodný, který
ruší zejména v soupravách používajících Mg2+ aktivátory (v
doporučených metodách A a B tyto aktivátory nejsou), kdy vzniká sraženina
fluoridu hořečnatého.
Lipémie do 22,8 mmol/l
triacylglyceridů neruší.
Certifikovaný referenční
materiál není zatím dostupný.
Interference
Žlučové kyseliny snižují aktivitu GGT a rovněž tak následující látky: azatioprin, klofibrát, konjugované estrogeny, metotrexát, ursodiol aj.
Orální kontraceptiva zvyšují aktivitu GGT o 20% a zvláště velký vzrůst katalytické koncentrace GGT byl pozorován u antikonvulziv jako je fenytoin nebo fenobarbital a to na čtyřnásobek u dětí a dvojnásobek u dospělých. Zvýšená aktivita je také vyvolána následujícími látkami: acetaminofen (někdy je toxický i v nízkých dávkách), aminoglutetimid, awelysin, difenylhydantoin, esterifikované estrogeny, etanol, fenotiazin, interferon α-n3, karbamazepin, medroxyprogesteron, sodanton, spasmoveralgin, streptokináza, kyselina valproová aj.
Další informace
Postupy pro
hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení
koncentrací proteinů
Petr Štern, 2009-11-03