Stanovení α-amylázy
celkové
Synonyma
4-α-D-glukan
glukanohydrolasa, 3.2.1.1;
α amylasa;
endoamylasa; Taka-amylasa A; glykogenasa; 1,4-α-D-glukanglukanohydrolasa
Chemické názvosloví
připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných
lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Prof. Kodíček uvádí celý název jako
jedno slovo, v anglickém názvosloví EC je kmenový základ (např.
glucanohydrolase) samostatně.
Preanalytická fáze
Stabilita 20 až 25 °C 7 dnů (sérum, plazma,
moč), 4 až 8 °C 8 týdnů (sérum, plazma),
resp. 26 týdnů (moč bez konzervačních přísad), –20 °C 30 týdnů (sérum, plazma).
Moč není doporučeno zamrazovat ani konzervovat. Aktivita v plazmě je vyšší
než v séru. Při stanovení v plazmě snižují všechna antikoagulancia
(zejména EDTA, oxalát a citran) s výjimkou heparinu aktivitu AMS, protože
váží Ca2+ ionty, které jsou potřebné pro funkci AMS. Pro analýzu
aktivity AMS technologii suchých reagencií lze použít pouze sérum. Fluoridové
ionty zvyšují aktivitu AMS. Moč je velmi nestabilní při pH < 7,0. Před
skladováním je potřeba upravit pH moče tak, aby bylo mírně alkalické.
Zředění lipemických sér může vyvolat zvýšení
aktivity AMS, neboť tato séra mohou obsahovat inhibitory, které falešně snižují
hodnotu AMS (asi 20 % pacientů s akutní pankreatitidou má hyperlipidémii).
Stanovení neruší
hemolýza do koncentrace hemoglobinu 2,5 g/l, vyšší koncentrace způsobují
inhibici. Stanovení ovlivňuje lipémie. Aktivitu AMS ovlivňuje podávání léků.
Popis metody
α-Amyláza EC 3.2.1.1 má 2 izoenzymy
(pankreatický a slinný) a poločas vymizení
3 – 6 h.
Při
chromolytickém postupu se
štěpí vhodný oligosacharid, který se skládá ze 4 – 7 maltóz a na jednom konci
má navázaný chromofor (p-nitrofenyl), zatímco na opačném konci blokační skupinu
(etyliden nebo benzyliden):
|
|
4‑nitrofenylmaltoheptaosid s blokovaným
neredukujícím se koncem
4-nitrofenylglykosidová část se dále štěpí
následujícím způsobem:
glukoamyláza
glykosid-PNP glukóza +
4-nitrofenylmaltosid
Glukoamyláza je exoamyláza, která štěpí
řetězec od konce, pokud už není blokovaný.
α-glukosidáza
4-nitrofenylmaltosid 2 glukóza
+ PNP (4-nitrofenol)
2. a 3. stupeň reakce probíhají dostatečně
rychle, takže kinetika reakce je už po 1 min konstantní. Endogenní glukóza při
reakci neruší. V současné době se neblokované substráty nepoužívají, protože
v tom případě je reakce extrémně citlivá na změny pH, takže je prakticky
nepoužitelná pro stanovení α-amylázy v moči.
V moderních soupravách je glukoamyláza
vynechána a 4-nitrofenylglykosidové části štěpí přímo α-glukosidáza.
Příklad typického složení reakční směsi:
4-nitrofenylmaltoheptaosid: 5 mmol/l
α-glukosidáza: 633 µkat/l
fosfátový pufr: 105 mmol/l
Přímá jednostupňová chromolytická metoda, která používá α-amylázu
jako jediný enzym vychází z 2-chlor-4-nitrofenylmaltotriosidu (CNP-G3):
α-amyláza
5 CNP-G3 3 CNP +
2 CNP-G2 + 3 G3 +
2-chlor-4-nitrofenol 2-chlor-4-nitrofenylmaltóza maltotrióza maltóza
Výtěžnost reakce je 96
%.
Sacharogenní postup (v ČR se nepoužívá) vychází z maltotetraózy:
α-amyláza
maltotetraóza + H2O 2 maltóza + maltooligosacharidy
maltofosforyláza
maltóza +
fosfát glukóza + β-glukóza-1-fosfát
β-fosfoglukomutáza
β-glukóza-1-fosfát glukóza-6-fosfát
glukóza-6-fosfát-
glukóza-6-fosfát + NAD+ 6-fosfoglukonát + NADH
dehydrogenáza
Nárůst absorbance při
340 nm vznikem NADH se sleduje fotometricky.
Příklad typického složení reakční směsi:
maltotetraóza: 5 g/l
NAD+: 2,5 mmol/l
maltofosforyláza: 50 µkat/l
α-fosfoglukomutáza: 16,7 µkat/l
glukóza-6-fofátdehydrogenáza: 100 µkat/l
Referenční postup měření katalytické koncentrace α-AMS v
krevním séru vypracovala
komise IFCC pro enzymové referenční systémy. Jako substrát byl použit
4,6-etyliden(G1)-4-nitrofenyl(G7)-α-(1→4)-D-maltoheptaosid (EPS) a
reakce probíhala v pufru HEPES (N-2-hydroxyetylpiperazin-N´-etansulfonová
kyselina):
α-AMS
EPS
+ H2O
4,6-etyliden-Gx + 4-nitrofenyl-G(7-x)
α-glukózaoxidáza
4-nitrofenyl-G(7-x) +
(7-x) H2O (7-x)
Glukóza + 4-nitrofenol
Vznik 4-nitrofenolu se sleduje kineticky při 405 nm. Jako modifikátory
enzymové reakce se používají CaCl2 a NaCl.
Složení finální reakční směsi:
HEPES 50 mmol/1 pH
(37 °C) 7 ± 0,03
EPS 5 mmol/l
chlorid sodný 70 mmol/l
chlorid vápenatý 1 mmol/l
α-glukosidáza (bacillus stearothermophilus 37 °C) 135 μkat/l
objemový poměr séra 0,03226 (1 : 31)
Molární absorpční koeficient 4-nitrofenolu závisí
na pH. Změna pH o 0,01 způsobuje
změnu v kinetice asi o 1 %. Proto je nutné
přesné nastavení pH.
Reakční podmínky měření
Teplota 37 °C ±
Vlnová délka 405 nm ± 1 nm
Pološířka vlnové délky ≤ 2 nm
Optická dráha (tloušťka kyvety)
Délka inkubace 60 s
Délka preinkubace 180 s
Interval měření 180 s
Počet bodů měření ≥ 6
Poznámky:
Kontaminace substrátu EPS 4-nitrofenyl-α-D-maltoheptaosidem (> 0,1 %) může
způsobit prodloužení preinkubační fáze a interferovat s měřením. Hovězí sérový albumin nesmí obsahovat proteázy.
Reagencie:
Roztok 1
Vodný roztok 313,1 mmol/l CaCl2.2H2O
Roztok 2
Vodný roztok 52,1 mmol/l HEPES a 86,13
mmol/l NaCl
Diluent pro reakční enzymy:
Vodný roztok 1,20 g/l
hovězího albuminu a 154 mmol/l NaCl
Roztok 3
16,9 mkat/l α-glukosidázy při
37 °C rozpuštěné v diluentu pro reakční enzymy
Reakční roztok:
Promíchá se 25 ml roztoku 2 s 0,25 ml roztoku 3. Stabilita při 2 – 8 °C
je 2 týdny.
Startovací roztok:
Vodný roztok 31 mmol/l EPS a 52,1 mmol/l HEPES adjustovaný pomocí 0,2
mol/l NaOH na pH 7,00 (37 ºC).
Postup měření:
2 ml reakčního roztoku vytemperovat
na teplotu 37 °C
Přidá se 80 µl vzorku, intenzivně
se promíchá a inkubuje po dobu 60 s
Přidá se 400 µl startovacího roztoku vytemperovaného na 37 °C, intenzivně se promíchá
Po 180 s inkubaci se měří přírůstek
absorbance po dobu 180 s.
Je třeba použít kvalitní spektrofotometr s vysokým stupněm rozlišení a
metrologicky ověřené
pipety a odměrné nádobí..
Reagenční blank:
K určení hodnoty reagenčního blanku se nahradí měřený vzorek roztokem
154 mmol/l NaCl. Postup měření je stejný jako při měření vzorku.
Poznámka: Počáteční absorbance
≤
Blank vzorku:
K určení hodnoty blanku vzorku se nahradí startovací roztok roztokem 154
mmol/l NaCl.. Postup měření je stejný jako při měření vzorku.
Poznámka: Hodnota blanku vzorku u referenčních
materiálů (kalibrátorů a/nebo kontrolních materiálů) nesmí překročit 1 % katalytické koncentrace ve vzorku.
Zdroje chyb:
Katalytická koncentrace α-glukosidázy
ve finální reakční směsi je rozdílně inhibována
specifickými matricemi měřených vzorků.
Kontaminace slinnou α-AMS vede k prudkému zvýšení naměřené
hodnoty nebo k významnému vzestupu hodnoty reagenčního blanku.
Výpočet:
Po odečtení hodnoty reagenčního blanku se vynásobí takto korigovaná
změna absorbance faktorem F = 3063 (měření při 405 nm, ε4-nitrofenolu
= 1012 m²/mol)
Katalytická
koncentrace α-amylázy
[μkat/l] = 3063 ΔA/Δt
Poznámky k analytické metodě
Turbidimetrické a
nefelometrické stanovení je založeno na enzymové degradaci substrátu a tedy
snížení měřeného zákalu. Tento postup lze obtížně standardizovat, protože
kvalita štěpeného substrátu je proměnlivá. Amyloklastická metoda štěpení jódu,
vázaného na škrob, se nepoužívá se stejných důvodů. Avšak podobný postup, kdy
je na škrob vázáno červené barvivo se na proužcích využívajících technologie
suchých reagencií používá dosud.
Při sacharogenním
postupu se syntetický oligosacharid štěpí na maltózu, která se maltázou
degraduje na glukózu a tu lze stanovit běžnými postupy (HK nebo GOD-POD)
s fotometrickou detekcí kinetické reakce nebo ampérometricky
s glukózovou elektrodou. Postup byl navržen jako referenční metoda, avšak
vyžaduje korekci na endogenní koncentraci glukózy v jednotlivých vzorcích
(sérový blank).
Nejběžnější je
použití p-nitrofenylglukosidů (např. maltoheptaosidu), které jsou přímo nebo
postupně (glukoamyláza, α-glukosidáza) hydrolyzovány na barevný (405 nm)
p-nitrofenol.
Tato chromolytická
metoda je přibližně třikrát citlivější než referenční metoda sacharogenní,
neboť molární absorptivita vznikajícího p-nitrofenolu je třikrát vyšší než u
NADH. Substrát vykazuje také stejnou aktivitu vůči pankreatickému i slinnému
izoenzymu. Neruší bilirubin ani glukóza. Pro standardizaci se doporučuje lidský
slinný izoenzym AMS.
Substrát musí mít
dlouhodobě udržitelnou kvalitu a rozumnou cenu. Reakce nesmí být ovlivněna
změnami reakčních podmínek ve svém průběhu (tj. pH, bílkoviny, koncentrace
glukózy a objemovým podílem vzorku). Reakční kinetika musí být nultého řádu
s počáteční fází prodlevy ≤ 3 min. Linearita metody je obvykle do 80
µkat/l. Korelace sacharogenní a chromolytické metody je velmi dobrá.
V současné době je k dispozici certifikovaný referenční materiál CRM
IFCC/IRMM 456 α‑amylase (Institute for Reference Materials and
Measurements, Geel – Belgie).
Toleranční limit EHK
(sérum, plazma): 21 %.
Interference
Fenobarbital
způsobuje snížení katalytické koncentrace AMS.
Řada léků zvyšuje aktivitu
AMS: amoxapin, azatioprin, betanechol, cimetidin, cis-platina, diazoxid,
dideoxyinosin, felbamát, fentanyl, fenylbutazon, fluvastatin, furosemid,
glukokortikoidy, hydantoinové deriváty, hydroflumetiazid, hydrochlorotiazid,
chlortalidon, cholinergika, izoniazid, jodid draselný, klozapin, kodein,
kyselina aminosalicylová, kyselina valproová, meperidin, merkaptopurin,
minocyklin, mirtazapin, morfin a další narkotika, pegaspargáza, penicilamin,
pentazocin, procyklidin, sulfametoxazol, sulfisoxazol, tiazidy aj.
Další informace
Postupy pro hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů
Petr Štern (2010-03-10)