Stanovení aspartátaminotransferázy (AST)

Stanovení aktivity aspartátaminotransferázy

 

Synonyma

L-aspartát:2-oxoglutarát aminotransferasa, EC 2.6.1.1;

aspartátaminotransferasa, aspartátaminotransferáza; aspartáttransaminasa, aspartáttransamináza;

L-aspartátaminotransferasa; L-aspartáttransaminasa; aspartát-α-ketoglutaráttransaminasa; L-aspartát-α-ketoglutaráttransaminasa; L-aspartát-2-ketoglutarátaminotransferasa; aspartát-2-oxoglutaráttransaminasa; L-aspartát-2-oxoglutaráttransaminasa; aspartát:2-oxoglutarátaminotransferasa; L-aspartát-2-oxoglutarátaminotransferasa; aspartylaminotransferasa; aminotransferasa kyseliny asparagové; AAT; AspT;

transaminasa A;

GOT; glutamát-oxalacetáttransaminasa; glutamát-oxaláttransaminasa; glutamát-oxalacetátaminotransferasa; glutamát-aspartáttransaminasa; glutamát-aspartátaminotransferasa;

2-oxoglutarát-glutamátaminotransferasa;

oxalacetát-aspartátaminotransferasa; oxalacetáttransferasa

 

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Prof. Kodíček uvádí celý název jako jedno slovo, v anglickém názvosloví EC je kmenový základ (např. aminotransferase) vždy samostatně.

 

Preanalytická fáze

Stabilita séra (supernatant třeba oddělit co nejdříve) je 20 až 25 °C 3 dny, 4 až 8 °C 7 dní, -20 °C 4 týdny.

Stanovení ovlivňuje věk, hmotnost, požití alkoholu. Ruší hemolýza (aktivita AST v erytrocytech 40x vyšší než v séru) a také trombolýza. Slabá hemolýzy zvyšuje výsledky o 10 %, takže nelze použít k analýze ani lehce hemolytické sérum. Naměřená hodnota při odběru vsedě je o 10 – 15 % vyšší, než hodnota při odběru vleže. Také během dne hodnoty kolísají o 15 – 21 %. Pokud se jako antikoagulans v plazmě použije citrát sodný, dochází k inhibici AST. Heparinizovaná plazma způsobuje zákal. Nelze pouřít heparinát amonný, neboť spotřebovává NADH (viz poznámky k metodě). Fyzická zátěž i intramuskulární injekce hodnoty zvyšují.

Makroenzym AST (vázaný na imunoglobulin) může způsobit nevysvětlitelné zvýšení AST při normálním ALT a CK.

 

Popis metody

L-aspartátaminotransferáza EC 2.6.1.1 katalyzuje přenos –NH₂ z kyseliny L-asparagové na   2-oxoglutarovou za vzniku kyselin oxaloctové a glutamové. Poločas vymizení AST je 17 h.

 

 

Přenos aminoskupiny může probíhat i opačným směrem.

Oxalacetát vznikající při reakci katalyzované aspartátaminotransferázou je dále redukován na malát enzymem malátdehydrogenázou s využitím NADH jako koenzymu.

 

 

Rychlost úbytku koncentrace NADH je úměrná aktivitě AST.

Stanovení aktivity AST je založeno na měření poklesu absorbance reakční směsi při 340 nm, dané změnou koncentrace redukované formy NADH na oxidovaný koenzym oxidoreduktáz NAD⁺ (nikotinamidadenindinukleotid) ve spřažené reakci s MD.

 

Činidla:

1.     Pufr Tris, L-aspartát (97 mmol/l Tris, 302 mmol/ L-aspartát, pH 7,8). Rozpustit 1,18 g  tris(hydroxymetyl)aminometanu a 4,02 g L-asparagové kyseliny v 80 ml destilované vody. Upravit na pH 7,8 pomocí 0,5 mol/l NaOH  a doplnit na 100 ml destilovanou vodou. Roztok je stabilní 6 měsíců při teplotě 0° až 4° C.

2.     Pufr Tris/kyselina chlorovodíková (97 mmol/l Tris, pH 7,8).  Rozpustit 1,18 g  tris(hydroxymetyl)aminometanu v 80 ml destilované vody. Upravit na pH 7,8 pomocí 0,5 mol/l HCl. Roztok se nechá ochladit na teplotu kalibrace a doplnit na 100 ml destilovanou vodou. Tento roztok (č. 2) je stabilní 6 měsíců při teplotě 0° až 4° C.

3.     Roztok pyridoxalfosfátu (6,3 mmol/l pyridoxalfosfátu). Rozpustit 16,7 mg pyridoxalfosfát monohydrátu v roztoku č. 2 a doplnit na objem 10 ml. Tento roztok (č. 3) je stabilní 2 týdny při 0° to 4° C, je-li skladován v tmavé láhvi.

4.     Redukovaný nikotinamidadenindinukleotid (11,3 mmol/l NADH). 16 mg sodné soli NADH (nebo ekvivalentní množství korigované na hydrataci vodou) v 2,0 ml roztoku 2. Tento roztok (č. 4) je stabilní 2 týdny při 0° to 4° C.

5.     Malátdehydrogenáza/laktátdehydrogenáza (880 µkat/l, resp. 1360 µkat/l).   Roztoky enzymů v glycerolu se smíchají podle jejich katalytických koncentrací a nastaví 50% glycerolem na požadovanou katalytickou koncentraci. Tento roztok (č. 5) je stabilní 6 měsíců při teplotě 0° až 4° C.

6.     Pracovní činidlo. Smíchat 100 ml roztoku 1 (Tris-aspartát) s 2 ml roztoku 3 (pyridoxalfosfát), 2 ml roztoku 4 (NADH) a 1 ml roztoku 5 (enzymy).

7.     Směs činidel pro blank (roztok č. 7). Smíchat 100 ml roztoku 2 (Tris-HCl) s 2 ml roztoku 3 (pyridoxalfosfát), 2 ml roztoku 4 (NADH) a 1 ml roztoku 5 (enzymy).

8.     2-Oxoglutarát (144 µmol/l). Rozpustit 273 mg dvojsodné soli 2-oxoglutarové kyseliny v 10 ml destilované vody. Upravit na pH 7,8 při 30° C pomocí HCl (5 mmol/l).

9.     Chlorid sodný (154 mmol/l). Rozpustit 0,9 g chloridu sodného v 100 ml vody. Tento roztok je stabilní 6 měsíců při 0° to 4° C. Nutno kontrolovat na kontaminaci bakteriemi.

 

Přístrojové vybavení: spektrofotometr se šíří spektrálního pásu ≤ 10 nm, umožňující měření při 339 nm s teplotně stabilizovanou kyvetou s výkyvy < 0,05 °C (možnost analogového zápisu se doporučuje).

1.     Do kyvety dávkovat 2,000 ml roztoku 6 (pracovní činidlo) a 0,200 ml séra.

2.     Smíchat a nechat stát 10 min.

3.     Sledovat absorbanci, abychom se ujistili, že je její hodnota stabilní.

4.     Přidat 0,200 ml roztoku 8 (2-oxoglutarát).

5.     Zamíchat a sledovat změnu absorbance po dobu 300 s. Není-li k dispozici zapisovač, sledovat hodnotu každých 15 s. ¨

6.     Opakujte kroky 1 až 5 s roztokem 7 pro změření blanku.

 

Výpočet

Je-li změna absorbance/s (ΔA/s) > 0,0025 nebo když klesá během kroku 3, je třeba ředit vzorek 5 až 10-krát roztokem 9 (0,154 mol NaCl/l) a zopakovat měření..

 

Korekce na blank se provádí následovně:

(ΔA/s) A =  měření reakce séra s roztokem 6

(ΔA/s) B =  měření reakce roztoku 2 a roztoku 6

(ΔA/s) C =  měření reakce séra s roztokem 7

(ΔA/s) D =  měření reakce roztoku 2 a roztoku 7

 

Pak při optické dráze kyvetou 10 mm:

(ΔA/s) korigovaná = [(ΔA/s)A  -  (ΔA/s)B]  -  [(ΔA/s)C  -  (ΔA/s)D]

 

Katalytická koncentrace v µkat/l odpovídá 1,905 x mA/s. Maximální přípustná změna blanku je 2 mA/min. Maximální strmost měření 132 mA/min.

 

Doporučená rutinní metoda stanovení: IFCC metoda pro 37 °C/ECCLS/DGKCh 94 new (různá označení pro stejnou metodu. Toleranční limit EHK: 21 %, CV % pro vnitřní kontrolu kvality: 7 %, teoretický toleranční limit: 23,1 %.

 

Kromě doporučené metody IFCC existují i další varianty následných enzymových reakcí po vzniku oxaloctové kyseliny, katalyzovaném AST:

 

 

Pyruvát se oxiduje na acetylfosfát a současně dochází k redukci kyslíku na peroxid vodíku, který přicházi do některé z variant Trinderovy reakce, kdy za katalýzy peroxidázou vzniká z leukobarviva barevná sloučenina (detekovaná fotometrem). Tento postup se používá při stanovení AST suchými reagenciemi na impregnovaných vláknech.                                                                                            

 

 

Metody použitelné pro screening

Pouze orientační reakce při epidemiologickém screeningu:

 

kyselina                                           Fast blue BB

oxaloctová                   N-(4-amino-2,5-dietoxyfenyl)benzamid

Lze použít i diazoniová barviva. Při vzniku vazby se metylenová skupina oxaloctové kyseliny mění na metinovou skupinu. Reakce je nespecifická, protože aktivovaná metylenová skupina se také vyskytuje v některých lécích a metabolických produktech pacientů s ledvinovým selháním.

 

 

kyselina            dinitrofenylhydrazin                        modrý oxalacetát-dinitrofenylhydrazon

oxaloctová

Fotometrické měření lze provádět v alkalickém prostředí při 340 nebo 505 nm.

Oxalacetát vznikající působením AST současně inhibuje aktivitu AST, takže v případě vysokých katalytických koncentrací stanovovaného enzymu jsou naměřené výsledky falešně nižší. Kromě toho jakýkoliv keton přítomný v séru (kyselina acetoctová nebo 3-hydroxymáselná) výsledky falešně zvyšuje.

 

Poznámky k analytické metodě

Doporučená metoda IFCC je v plném rozsahu obtížně aplikovatelná zvláště u rychlých analyzátorů s velmi malým měřícím objemem.

Metoda musí být dvoučinidlová. Druhé činidlo je pouze 2-oxoglutarát. V prvním činidle musí být bezpodmínečně NADH, LD, aby došlo k likvidaci endogenního pyruvátu v měřeném materiálu před přidáním druhého činidla. Některé firmy označují svůj postup « like IFCC » a přitom mají NADH ve druhém činidle, kde se snadněji udrží jeho stabilita. 

Doporučovaná inkubace s prvním činidlem je 5 min, po přidání druhého činidla 90 s a doba měření 180 s. Většina analyzátorů neumožňuje tak dlouhý reakční čas. Nicméně doporučujeme co nejméně zkracovat inkubaci s prvním činidlem. Dostačující fáze prodlevy po přidání druhého činidla je 30 s, pro měření 60 s (minimálně 6 bodů). Jestliže je maximální reakční čas analyzátoru 6,5 min, umožněte inkubaci s prvním činidlem 5 min. Pokud není jiná možnost zkraťte ji tak, abyste zcela naplnili maximální reakční čas analyzátoru. Čím více budete tuto fázi analýzy zkracovat, tím více zvyšujete riziko falešně vyšších výsledků u pacientů s vysokou hladinou endogenního pyruvátu.

V buňkách se vyskytuje holoenzym AST (apoenzym + koenzym), ale  v séru může být již část AST zbavená koenzymu. Proto reakce vyžaduje vysycení ALT pyridoxalfosfátem (kofaktor přenosu aminoskupin). Pokud nepoužijete vitamin B₆, jedná se o postup non lege artis (pacienti s hypovitaminózou B₆ mají falešně nízké výsledky). Koenzym B₆ zvyšuje aktivitu AST až o 50 %. Metody bez přídavku pyridoxalfosfátu dávají v průměru o 20 % nižší výsledky.  Pyridoxalfosfát je vždy v prvním činidle. Vysycení probíhá zvolna a to je další důvod, proč se nemá první inkubace zkracovat. Čistý apoenzym se také často vyskytuje v kontrolních sérech, které jsou obohacovány čištěnými enzymy.

Doporučená délka optické dráhy kyvetou je 10 mm, některé analyzátory mají jen 7 mm. S tím se nedá nic dělat, ale je třeba si uvědomit, že citlivost měření se snižuje asi o jednu třetinu.

Doporučená minimální koncentrace NADH je 180 µmol/l, aktivita LD 15 µkat/l, MD 10 µkat/l. Jsou to drahé chemikálie a firmy někdy šetří. Nicméně vyšší koncentrace, resp. aktivity uvedených reagencií nevadí.

Poměr vzorku a reakční směsi 1:12, takže použijete-li sumárně 160 µl činidel je třeba dávkovat 15 µl vzorku. Linearita metody je za těchto podmínek přibližně do 6,0 µkat/l. Certifikovaný referenční materiál není zatím dostupný.

Při stanovení ruší endogenní sérová glutamátdehydrogenáza, která se může objevit u pacientů s onemocněním jater. Za přítomnosti ammoných iontů se při tvorbě glutamátu z 2-oxoglutarátu v oxidoredukční reakci současně spotřebovává NADH na NAD⁺.

Při nedostatečné purifikaci LD a MD se mohou v reagenciích vyskytnout AST a GLD.

Použije-li se fosfátový pufr, zpomalí se připojení koenzymu B₆ k apoenzymu a v případě většího množství volného endogenního AST můžeme naměřit falešně nižší výsledky.

Stabilita NADH v pufru Tris je nižší než ve fosfátovém pufru, proto se nedoporučuje koncentrace Tris > 80 mmol/l ve výsledné reakční směsi. 

Při stanovení suchými reagenciemi na impregnovaných vláknech ruší vysoká koncentrace pyruvátu ve vzorku, jakož i vysoké množství imunoglobulinu (mnohočetný myelom).

 

Interference

Snížené aktivity AST jsou u alopurinolu, cyklosporinu, progesteronu aj.

Řada léků způsobuje zvýšení aktivity AST: acetaminofen, amikacin, amiodaron, amitriptylin, anabolické steroidy, antikonvulsanty, aspirin, cefalosporiny, diklofenak, erytromycin, fenobarbital, fenotiazin, flukonazol, gentamicin, haloperidol, halotan, hydralazin, chinidin, chlorambucil, chloroform, chlortiazid, chlorpromazin, ibuprofen, indometacin, α₂-interferon, izoniazid, izoproterenol, karbamazepin, karbenicilin, ketokonazol, konjugované estrogeny, kyselina aminosalicylová, kyselina askorbová, kyselina mefenamová, kyselina valproová, levedopa, lipovitan, lovastatin, meprobamat, metotrexat, metronidazol, metyldopa, metyltestosteron, naproxen, nesteroidní protizánětlivá činidla, netromycin, niacin, nitrofurantoin, nortriptylin, opiáty, orální kontraceptiva, oxacilin, papaverin, penicilamin, penicilin, progesteron, propyltiouracil, pyrazinamid, pyridoxin, rifampin, ritonavir, streptomycin, sulfonamidy, tamoxifen, tikarcilin, tetracyklin, tobramycin, tokainamid, tolbutamid, verapamil aj.

 

Další informace

Principy analytických postupů

Postupy pro hodnocení aktivit enzymů

Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů

 

 

 

Petr Štern, 2009-11-03