Stanovení
aktivity alkalické fosfatázy
Synonyma
fosfát-monoester fosfohydrolasa, EC 3.1.3.1;
alkalická fosfomonoesterasa; fosfomonoesterasa;
glycerofosfatasa; alkalická fenylfosfatasa;
alkalická fosfohydrolasa; ortofosforečný monoester fosfohydrolasy.
Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní
pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza.
Mezinárodně uznávaná zkratka enzymu neexistuje, ale běžně se používá označení
AP (Google 8 440 000), případně ALP (Google 537 000).
Preanalytická fáze
Odebírat nalačno. Stabilita vzorku: 18 - 26 °C: 4 h (sérum),
2 dny (plazma – heparinát sodný), 2 - 8 °C: 3 dny, -20 °C: 4 týdny. Při
rozmrazování se aktivita ALP zvyšuje.
Při
analýze lyofilizovaných sér po rekonstituci vodou nutno vyčkat > 90 min,
jinak jsou výsledky vyšší !
Koncentrace ALP v erytrocytech je šestkrát vyšší než
v séru a hemolýza proto výsledky měření falešně zvyšuje. Bilirubin tvoří
diazoniovou sůl s α-naftylfosfátem a při fotometrii interferuje
s p-nitrofenolem. Je-li vzorek při teplotě 56 °C 30 – 60 min, ztrácí ALP
80 -90 % aktivity.
Poznámky k
analytické metodě
Normální hodnoty aktivity ALP závisí na použité
metodě, věku (po 50. roku života hodnoty stoupají a to více u žen než u mužů),
pohlaví, případně těhotenství (pokles hodnot ve 2. – 4. měsíci, ve 3. trimestru
aktivita ALP vyšší 2 – 3-krát). U vegetariánů jsou normální hodnoty asi o
polovinu vyšší.
Pro
aktivitu enzymu je zapotřebí hořečnatých a zinečnatých iontů, jakož i serin.
Proto je aktivita ALP významně inhibována při použití EDTA, oxalátu nebo
citranu jako antikoagulancií. Výsledky také snižují cystin, cystein, fluoridy a
vápenaté ionty. Použití glycinu jako pufru vede k vytvoření komplexu
s hořečnatými ionty. Je-li použito činidlo s vysokým obsahem fosfátů,
také to vede k inhibici měřené reakce. Jsou-li použity v činidle soli
manganu, dochází k aktivaci enzymu. Přidání sodných iontů ve vhodné
koncentraci (90 – 120 mmol/l) zvyšuje aktivitu ALP přibližně o 16 %.
Optimální
pH reakce je mezi 9 – 10 a záleží na použitém pufru a substrátu. Nejvíce
využívaným substrátem je p-nitrofenylfosfát, který je bezbarvá, zatímco reakční
produkt p-nitrofenol intenzivně absorbuje při 403 nm. Transfosforylační pufry
(2-metyl-2-amino-1-propanol – AMP, dietanolamin – DEA,
tris(hydroxyaminometyl)metan – Tris, N-methyl-d-glukamin – MEG) významně
zvyšují rychlost reakce vzhledem ke klasickým pufrům (veronalový, uhličitanový,
glycinový). Jako akcelerátor reakce se někdy používá také manitol. Pufr AMP
aktivuje více střevní než jaterní a kostní izoenzym.
Dalším
používaným substrátem je α-naftylfosfát a detekce α-naftolu je při
340 nm (pH 10, uhličitanový pufr, přísada MgCl2). Byly popsány i
fenolftaleinmonofosfát a tymolftaleinfosfát.
Fluorimetrie
používá 4-metylumbeliferylfosfát jako substrát a detekce 7-metylumbeliferonu se
provádí při emisní záření 360 nm a excitačním záření 465 nm (uhličitanový pufr,
pH 9,2). Kromě detekce fotometrem lze použít také HPLC postup
s elektrochemickým detektorem (substrátem je fenylfosfát, detekovaný
produkt je fenol).
Metoda
s p-nitrofenylfosfátem a AMP pufrem je kandidátkou na referenční metodu
Národní komise pro standardy v klinických laboratořích a expertního panelu
pro enzymy (NCCLS/EPE) s CV v sérii 3 – 6 %, ale mezilaboratorní CV je 17
– 28 %.
Velmi
důležitá je čistota transfosforylačních pufrů (zvyšují aktivitu ALP 2 až
6-krát). V DEA bývá významné množství monoetanolaminu (MEA). AMP může
obsahovat inhibitory ALP jako jsou diaminy a
5-amino-3-aza-2,2,5-trimetylhexanol, které inaktivují enzym tím, že se vážou na
zinečnaté ionty. Nečistoty se odstraňují zinečnatou solí kyseliny
N-(2-hydroxyetyl)etylendiaminotrioctové. Pufr MEG (prof. Chromý) je jen
průměrným akceptorem fosfátů, ale neobsahuje inhibitory jako aminoalkoholové
pufry. Jeho výhodou ve srovnání s DEA je optimální pK = 9,63, téměř stejná
reaktivita všech izoenzymů ALP a nízká viskozita.
V p-nitrofenylfosfátu
může být obsažen p-nitrofenol (vysoký činidlový blank), nebo vzniká spontánně
(činidlový blank), případně jsou přítomné fosfáty (inhibice reakce).
Je-li podíl séra v celkovém reakčním
objemu 0,02 dochází při ředění k lepší disociaci agregátů ALP a tím
k vyšší aktivitě enzymu. Linearita metod je obvykle v rozmezí 30 s – 15
min. Vzorky do aktivity 30 µkat/l lze zpracovat bez ředění. Doporučuje se start
substrátem (v nutných případech vzorkem). Preinkubace do 5 min – možnost
inaktivace kostní ALP !
ALP
v prostředí MEG vykazuje o 30 % vyšší aktivitu než v AMP.
Certifikovaný referenční materiál viz Schiele F, Muller
J, Colinet E, Siest G: Certification of an enzyme reference material for
alkaline phosphatase (CRM 371) Clin Biochem 24:159-168, 1991.
Interference
Některé přípravky aktivitu alkalické fosfatázy snižují: azatioprin,
cyklosporin (po počátečním přechodném zvýšení aktivity ALP), klofibrát aj.
Řada látek způsobuje zvýšení aktivity alkalické fosfatázy: aminoglykosidy, amiodaron, anopyrin,
antikonvulsiva, aspirin (při dlouhodobém užívání), erytromycin, esterifikované
estrogeny samotné nebo v kombinaci s androgeny (mohou také aktivitu
snižovat !), etanol, fenobarbital,
fenotiaziny, chlorpromazin, interleukin-2, izoniazid, levotyroxin,
lithium, orální kontraceptiva, rytmochin II, spasmoveralgin, verapamil aj.
Všechny léky vyvolávající cholestázu způsobují zvýšení aktivity ALP, které může
být až desetinásobné.
Další informace
Postupy pro
hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro
hodnocení koncentrací proteinů
Petr Štern, 2009-11-03