LDL (apo B/E) receptor je společný receptor pro LDL částice, který se vyskytuje ve většině tkání. Strukturálně je dosud nejlépe specifikovaný, do stejné rodiny s ním patří též receptory pro VLDL a chylomikrony. Práce Michaela S. Browna a Josefa L Golsteina učinila mnohé pro vysvětlení metabolické cesty receptorů pro LDL a jejich role v metabolismu lipidů a aterogenezi, jakož i pro molekulární genetiku familiární hypercholesterolémie. Homozygotně postiženým  chybí kompletně receptory pro LDL. Jednotlivé strukturální podjednotky LDL receptorů mohou jevit různé typy defektů.

 

Modely LDL receptorů a jejich ligandů

Mezi receptory pro LDL a proteiny jiných rodin existuje značná regionální homologie. U receptoru LDL se rozeznává pět domén.

 

První doména

Extracelulární část LDL receptorů je složena z aminokyselinového konce, který obsahuje první, ligandy vázající doménu. Vždy se jedná o sedm opakování cca 40 aminokyselin sestavených do hlavy ocasu. Poblíž karboxylového konce každého opakování je shluk negativně nabitých mastných kyselin, které váží pozitivně nabité aminokyseliny apo-E a apo-B. Stranově vychýlené mutace těchto domén ukázaly, že determinanty receptorů pro vazbu LDL a b-VLDL se vzájemně liší. 

 

Druhá doména

Druhá doména je velmi podobná prekurzoru epiteloidního růstového faktoru (EGF). Tato doména je třeba k disociaci receptoru v kyselém prostředí a ligandu uvnitř endozómu, ne však pro samu vazbu b-VLDL.

 

Třetí doména

Role třetí domény (malé a bohaté na serinové a treoninové zbytky), která obsahuje rovněž cyklicky vázané cukry, není dosud známa.

 

Čtvrtá doména

Čtvrtá doména obsahuje 22 zbytků aminokyselin a přetíná celou membránu, a proto snad představuje integrální protein (?).

 

Pátá doména

Pátá, terminální, karboxylová doména je intracelulární a cílí recyklující receptor ke skrytým jamkám.

 

Funkce receptoru

Každá částice LDL obsahuje jako jediný protein jen jednu molekulu apo-B-100. Většina dělících se buněk má receptory, které váží LDL prostřednictvím specifického ligandu v jeho apo-B-100. Vazbou nastává série procesů: LDL se váže na receptory umístěné v skrytých jamkách buněčného povrchu. Skryté jamky se zavřou a utvoří skryté jímky, které se mění na endozómy a ty poté disociují na LDL váček a LDL receptorový váček. Receptorový váček pak recykluje k buněčnému povrchu a zbývající endozóm se mění v lysozóm. Uvnitř lysozómu hydrolyzují kyselé esterázy a proteázy lipidy a proteiny na mastné kyseliny, volný cholesterol a aminokyseliny. Je-li volný cholesterol v nadbytku, mění se na estery cholesterolu. Uvnitř endoplazmatického retikula snižuje volný cholesterol produkci LDL receptorů a pro biosyntézu cholesterolu klíčového enzymu tj. HMG-CoA reduktázy - asociací cholesterolu s proteiny, které ovlivňují aktivitu mRNA regulačních vazných proteinů jak pro HMG-CoA reduktázu tak pro LDL receptor. Při nedostatku buněčného cholesterolu jsou syntetizovány dodatečné receptory pro jeho záchyt a po modifikaci v Golgiho aparátu se přesunují k buněčnému povrchu.

 

Z modelu vyplývá, jak aktivita LDL receptorů reguluje koncentraci plazmatického cholesterolu a jakým způsobem nedostatek LDL receptorů zvyšuje cholesterol v plazmě. Není-li u jedince z nějakého důvodu receptory zprostředkovaný záchyt LDL částic možný, koncentrace cholesterolu v plazmě se zvyšuje. Zároveň v důsledku nedostatečného přísunu cholesterolu z LDL, jež obvykle vede ke snížení jeho endogenní produkce, je tato zpětnovazební regulace tvorby cholesterolu znemožněna a buňka cholesterol neustále tvoří a vylučuje, i když není zapotřebí. Kdyby zároveň neexistoval jiný  tzv. nespecifický mechanismus odstraňování LDL z plazmy, mohly by plazmatické koncentrace celkového cholesterolu u homozygotů s familiární hypercholestrolémií dosáhnout hodnot vyšších než 18,0 mmol/l (cca 700 mg/l). U normálních jedinců asi 70 % plazmatických LDL částic je odstraněna játry prostřednictvím LDL receptorů, zbytek částic mizí záchytem nespecifickým. Nespecifický záchyt nelze ovšem považovat za plnohodnotou alternativu receptorového záchytu.

 

Nový text:

Odstraňování LDL z cirkulace.

Zásobování buněk cholesterolem receptorově zprostředkovanou endocytózou LDL je jedním z nejlépe charakterizovaných  procesů makromolekulárního transportu přes plazmatickou membránu eukaryotických buněk.

 

Receptorově zprostředkovaná endocytóza

Lipoproteinová částice se nejprve váže na jeden z 15000 LDL-receptorů na povrchu buňky. Tyto receptory nejsou na povrchu buňky rozloženy rovnoměrně, nýbrž 80% z nich je lokalizováno ve speciálních regiónech plasmatické membrány zahrnujících jen 2 % buněčného povrchu. Tyto oblasti tvoří jamky a jsou ohraničené na jejich cytoplasmatické straně materiálem, který má v elektronovém mikroskopu zjev chlupatého pláště. Každá z těchto tzv. opláštěných jamek obsahuje vedle LDL receptorů i mnoho druhů dalších endocytárních receptorů, ale LDL částice se vážou jen ke „svým“ receptorům  v důsledku jejich extrémně vysoké afinity a specifičnosti. Vzniklý komplex receptoru s LDL částicí podléhá rychlé invaginaci opláštěné jamky, která eventuelně kulminuje  jejím uvolněním do nitra buňky. V této chvíli je opláštěná jamka transformována do endocytárního „opláštěného váčku“, membránou obklopené organely , která je pokrytá ne její externí (cytoplasmatické ) straně polygonální sítí fibrózních proteinů, jejichž hlavní strukturní součástí je zvláštní protein zvaný klathrin. Poté je plášť rychle odstraněn současně s acidifikací vnitřku váčku a fúzí dalších neoplášťovaných endocytárních váčků. Přechodně se LDL a receptor nacházejí v hladkých váčcích, v nichž se lipoproteinová částice oddělí od receptoru vlivem kyselého prostředí. LDL je poté dopraven do lysozómů, tam je degradován, zatímco receptor tento osud míjí, je recyklován zpět k buněčnému povrchu, kde kotví znovu jako opláštěná jamka připravená vázat a internalizovat nové vazné molekuly.

 

Metabolismus LDL receptorů

Receptory LDL tvoří klíčovou složku zpětné regulace při udržování homeostázy cholesterolu v těle. Jako aktivní spojení mezi extra- a intracelulární zásobou cholesterolu jsou samy o sobě regulovány na buněčné úrovni. Cholesterol odvozený od LDL (generovaný hydrolýzou esterů cholesterolu  LDL částic) a intracelulárně generované oxidační deriváty zprostředkovávají komplexní sérii zpětných kontrolních mechanismů, které buňku chrání před akumulací cholesterolu.

1. (oxy)steroly potlačí činnost 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA(HMG-CoA) syntetázy, a HMG-CoA reduktázy, dvou klíčových enzymů v buněčné biosyntéze.
2.  cholesterol aktivuje cytoplazmatický enzym acyl-CoA:cholesterol acyltransferázy (ACAT;E.C.2.3.1.26), což dovolí buňkám uskladnit přebytek cholesterolu v reesterifikované formě.
3.  tvorba nových LDL receptorů je potlačena, což zabrání dalšímu přívodu LDL do buněk a tím jejich přeplnění cholesterolem. Koordinace regulace LDL receptorů a enzymů syntetizujících cholesterol se opírá o steroly modulovanou proteolýzu membránově vázaného transkripčního faktoru (SREB).

 

Celkový profitem  a důsledkem receptorově zprostředkovaného regulačního systému je koordinace  utilizace intra- a extracelulárních zdrojů cholesterolu na systémové úrovni. Savčí buňky jsou schopné se živit v nepřítomnosti lipoproteinů, neboť dovedou cholesterol vytvořit z acetyl-CoA. Jsou-li však LDL částice dostupné, většina buněk primárně užívá LDL receptorů k importu cholesterolu a jejich vlastní syntetická aktivita je potlačena. Tak je udržována konstantní hladina cholesterolu v buňce zatímco externí přívod z lipoproteinů může podléhat značné fluktuaci.

 

Většina ze současných poznatků vznikla na základě detailních studií v kulturách fibroblastů normálních jedinců a pacientů s familiární hypercholesterolémií (FH). Nedostatek výše popsaných regulačních vlastností fibroblastů vedl k závěru, že abnormální fenotyp je způsoben funkčním nedostatkem LDL receptorů a tím i rozvrácením metabolismu LDL receptorů. Zvláště je porušena rovnováha mezi zásobami extra- a intracelulárního cholesterolu. Klinicky nejzávažnějším důsledkem nedostatku LDL receptorů je hypercholesterolémie s následnou akcelerovanou aterosklerózou a jejími komplikacemi.

 

Vztah mezi strukturou a funkcí LDL receptoru

Zralý LDL receptor je vysoce konzervovaný integrální membránový glykoprotein skládající se z pěti domén v celkové délce  839 zbytků:

1. domény vázající ligandy
2. domény s vysokým stupněm homologie s prekurzorem epidermálního růstového faktoru (EGFP)
3. domény, která obsahuje shluk O-vázaných řetězců karbohydrátů
4. transmembránové domény
5. krátké cytoplazmatické oblasti

 

Pět domén ve zralém proteinu následuje za sebou od N-terminálního konce k C-terminálnímu  následovně:

 

Ad 1. Doména vázající ligandy

Doména o cca 40 zbytcích zprostředkovávající interakci mezi receptorem a lipoproteiny obsahujícími apo B100 a / nebo apo E v amino-terminálním konci receptoru.  Doménu charakterizuje sedm opakování bohatých na cystein  (vždy  6 cysteinů),  což napomáhá k jejímu poskládání do rigidní struktury. Každé opakování obsahuje shluk negativně nabitých kyselin, jejichž jádro se skládá z Ser-Asp-Glu („SDE“); opakování  2-7 se kooperativně váží  s apo B100 a apo E.

 

Ad 2. Doména s vysokým stupněm homologie s prekurzorem epidermálního růstového faktoru

Tato oblast LDL receptoru přiléhá k místu vázající ligandy a skládá se z cca 400 aminokyselin (centrální pentagon)  a její  výjimečnou vlastností je výrazná sekvenční podobnost  se třemi motivy EGFP  známými jako „opakování růstového faktoru“. Dvě taková opakování jsou umístěná v tandemu v aminokyselinovém konci a další  na C-terminálním konci této oblasti LDL receptoru. Zbytek se skládá z pěti sledů o cca 50 zbytcích, jež obsahují tetrapeptidové sekvence v souladu s Tyr-Trp-Thr-Asp (YWTD). Tato oblast se podle výzkumů účastní disociaci receptoru od LDL závislé na kyselém prostředí a jeho následné recyklaci.

 

Ad 3. O-vázaná karbohydrátová doména

O-vázaná karbohydrátová doména lidského LDL receptoru je proužek o 58  aminokyselinách vysoce bohatý na serinové  a threoninové  zbytky (celkem 18), umístěnými vně plasmatické membrány. Většina, ne však všechny, z jeho 18 postranních hydroxylovaných kyselinových řetězců je glykosylováno. O-vázané oligosacharidy se postupně prodlužují v kurzu syntézy receptoru a při jeho zrání: poté, co opustí ER, je jediným přítomným O-vázaných cukrem N-acetylgalaktosamin a při průchodu Golgiho aparátem jsou přidávány galaktosylové a sialové zbytky. Navzdory detailním znalostem o struktuře této oblasti zůstává její význam nejasný.

 

Ad 4. Doména kotvící v membráně (transmembránová doména)

Jednoduchá, membránu překlenující doména, zakotvená v membráně leží karboxy-terminálně k O-vázanému karbohydrátovému shluku. Skládá se z 22-25 hydrofóbních aminokyselin; a zcela dle očekávání, delece této domény v přirozeně se vyskytujících mutacích nebo cílenou polohovou mutagenezí vede k sekreci větvených receptorů z buněk.

 

Ad 5. Cytoplasmatický ocas

Cytoplasmatický ocas LDL receptoru se skládá z krátkého spojení 50 aminokyselinových zbytků zapojených do cílení LDL receptorů  k opláštěným jamkám. Přirozeně se vyskytující mutace a stranově specifické mutageneze  odhalily  v ocase „internalizační sekvenci“ Asn-Pro-Xxx-Tyr (NpxY; x označuje jakoukoli AMK, často valin). V současnosti se cytoplasmatické domény LDL receptoru a jejich strukturní obdoby ocitly v novém ohnisku pohledu, neboť drží klíč z zapojení receptorů do signální transdukce.

 

Lidský gen pro LDL receptor a jeho přirozené mutace

Lidský gen pro LDL receptor obsahuje 18 exonů a je lokalizován na distálním krátkém raménku 19. chromozómu. Existuje silná korelace mezi funkčními doménami  proteinu a organizací exonů v genu.

Např. sedm  na cystein bohatých opakování domény vázající ligandy je kódováno exony 2 (opakování 1), 3 (opakování 2), 4 (opakování 3,4,5), 5 (opakování 6) a 6 (opakování 7). S růstovým hormonem homologní doména je kódována 8 exony organizovaných velmi podobným způsobem jako ve vlastním  genu pro EGFP.

Třetí doména je přepisována z jediného exonu mezi introny 14 a 15. Gen pro LDL receptor tedy představuje sdružení skrytých kódovacích sekvencí; ve skutečnosti  existuje mnoho molekul obsahujících všechny nebo některé z těchto prvků a pravděpodobně mnohé budou ještě odhaleny. Byly odhaleny mnohé proteiny se shluky ligandy vázajících opakování v extracelulárních doménách, považované za příbuzné tzv. LDL receptorové rodiny.

Mulekulárně genetické výzkumy pacientů s FH odhalily více než 600 různých mutací genu pro LDL receptor. Seznam všech mutací s originálními citacemi lze nalézt na http:://www.ucl.ac.uk/fh/.

 

Současné  zjednodušené rozdělení mutací do 5 tříd dle jejich účinku na protein je následující:

1. třída 1: nulová alela – receptor není stanovitelný: Tito mutanti neprodukují žádný  odpovídající receptorový protein a buňky s touto mutací nejsou schopny vázat LDL částice. Jedná se o bodové mutace působící časné ukončení kodónů v oblasti kódování proteinu, mutace promotorové oblasti, které blokují transkripci, mutace vedoucí k abnormálnímu střihu a/nebo nestabilitě mRNA, a velké delece.
2. třída 2. : pomalé nebo žádné výroba prekurzoru receptoru: Tyto alely představují cca ½ všech mutací alel pro LDL receptor a  jejich důsledkem jsou transportně vadné prekurzory LDL receptoru, které se nedovedou normální rychlostí  přemístit z ER do Golgiho aparátu a poté k buněčnému povrchu. Důsledkem je typický náhlý vzrůst Mr během biosyntézy při nedostatku LDL receptoru. Některé mutace zajistí alespoň pomalý pohyb prekurzorů receptoru z ER, jiné vedou ke kompletnímu zastavení  resp. totální absenci transportu z ER, kde  zmutované receptory nikdy nedoputují k buněčnému povrchu.
3. třída 3: defektní vazba ligandů: Tyto receptory obecně doputují v buněčnému povrchu  normální rychlostí, ale nejsou schopny účinně vázat LDL  pro jemné strukturální změny v blízkosti ligandy vázající domény. Tyto mutanti procházejí normálním maturačním procesem.
4. třída 4: defekty internalizace: u těchto mutantů schází jeden z důležitých předpokladů internalizace: lokalizace LDL receptorů v opláštěných jamkách. Chyba těchto receptor znemožňujících internalizaci ligandů spočívá v neschopnosti lokalizovat opláštěné struktury a vyplývá z mutací, které přímo či nepřímo ničí C-terminální doménu receptoru. Byly identifikovány 4 typy mutací, u nichž velké delece vedou k nedostatku cytoplasmatické a transmembránové domény;  většina z těchto mutantních větvených proteinů je vyloučena z buňky.
třída 5: defektní recyklace: Po deleci prvních dvou EGFP domén  lidského LDL receptoru  sice větvený receptor váže a internalizuje ligand, ale neumí jej uvolnit v kyselém prostředí endosómu. Mutantní receptor je rychle degradován aniž by se prázdný vrátil k povrchu buňky. Mutace zasahují do EGFP domény, zejména do jejich oblastí YWTD.

 

Literatura

·         M. Gotto: Manual of Lipid Disorders, Williams & Wilkins 1999;

·         Kol.autorů: Lékařská chemie a biochemie, Avicenum Osveta1990;

·         D. Voet, J. Voetová: Biochemie, Victoria Publishing1990;

·         R. K. Murray, D.K. Granner, P. A.Mayes, V. W.Rodwell: Harperova Biochemie, H&H Nakladatelství a vydavatelství 1998;

·     J. Masopust: Klinická biochemie, požadování a hodnocení biochemických vyšetření, Karolinum

       Praha 1998

·     D.E. Vance & J.E. Vance: Biochemistry od Lipids, Lipoproteins and Membranes, 4th Edi, 2002