Konfokální mikroskopie
Světelným zdrojem je laserové záření. Konfokální mikroskop poskytuje mimořádně ostrý, kontrastní, vysoce informativní obraz s vysokým rozlišením. Struktury nacházející se nad a pod rovinou fokusace nemají téměř žádný vliv na kvalitu obrazu. Hloubka ostrosti obrazu je vždy minimální.
X-y skenovací konfokální mikroskop
Tlustý vzorek rozptyluje světlo nebo se v něm budí fluorescence. Laserový paprsek osvětluje preparát v bodech A i B. Filtr dále propouští jen fluorescenční záření. Paprsky z bodu A se protínají v obraze A´ a otvorem procházejí do detektoru, jehož signál určuje jas bodu na monitoru, který přísluší místu na vzorku, kam dopadá paprsek z laseru. Skenování vzorku v rovině x-y řídí počítač. Fluorescenční záření z bodu B je v rovině stínítka s otvorem rozostřeno a malá část, která projde otvorem, zhoršuje kontrast snímku. Na jinou rovinu se zaostří posuvem stínítka s otvory.
Princip: buněčné struktury, které chceme pozorovat, obarvíme fluorochromem. Laserový paprsek je zaostřen do zvolené roviny, která buňkou prochází jako imaginární řez.V této zvolené rovině dojde k osvícení preparátu laserovým paprskem a fluorochrom emituje viditelné záření. Získaný obraz je zaznamenán počítačem. Postupnou změnou zaostření je možné získat obraz z více rovin (imaginárních řezů) – od vršku až ke spodu buňky. Zde je nejlépe patrný rozdíl proti klasické fluorescenční mikroskopii, kde září fluorochrom ve všech optických rovinách najednou (nelze tedy určit, co je nahoře a co je dole, uprostřed, atd.).
Pokud následně chceme provést 3D rekonstrukci obrazu, vzdálenosti mezi jednotlivými rovinami snímání by měly být vždy menší než hloubka ostrosti jednotlivých snímků. Po pořízení snímků z více rovin (běžně cca 30-60) se jednotlivé snímky „poskládají“ podle osy z (seřadí nad sebe podle pořadí snímání). Takto získáme pro každý bod pozorovaného objektu konkrétní hodnotu jasu (pro daný fluorochrom). Poté lze měnit libovolně směr/úhel pohledu a tím pádem je možné objekt zobrazit z libovolné strany (zorného úhlu) - dokonce lze objekt zobrazit i z boku nebo zespodu (všechna obrazová data ze všech virtuálních „řezů“ jsou totiž uložena v PC). Vše je znovu vypočítáno pro nově zvolený směr/úhel pohledu (podle obrazových dat ze všech zobrazených vrstev) a následně je vygenerován pohled na objekt z námi zvoleného směru/úhlu. V současné době software již umožňuje také zobrazení 3D perspektivní - tj. takové, kdy bližší části objektu (buňky) se jeví jako větší než části vzdálenější. Softwarová simulace částečné průhlednosti/neprůhlednosti objektu je nutná, abychom mohli rozlišit, co je více nahoře nebo dole.
Pro dosažení vyšší ostrosti obrazu lze dále použít dekonvoluci.Dekonvoluce je matematická metoda korekce objektů. Je-li znám stupeň zkreslení (tj. lze ho matematicky popsat jako konvoluci pomocí funkcí bodových pokryvů), pak lze obraz podrobit dekonvoluci. Obraz po dekonvoluci se tak více podobá skutečnému tvaru objektu než obraz získaný mikroskopem a stává se tak ostřejší, s menším šumem a větším rozlišením. Prakticky se dekonvoluce provádí tak, že se pomocí konkrétného mikroskopu pořídí snímky malé latexové kuličky (známe její tvar) a podle získaných snímků se stanoví míra zkreslení dané optické soustavy. Následně je získaný obraz přepočítán tak, aby kulička byla zobrazena jako kulička. Tato korekce se poté používá i pro ostatní objekty.
Je možné zároveň použít několik fluorochromů (poskytujících různou barvu excitovaného světla), kdy se každý fluorochrom naváže na jinou buněčnou strukturu. Potom je vhodnější použít tzv. sekvenční skenování – postupné snímání emitovaného záření různých fluorochromů, kdy se tyto fluorochromy liší i použitým laserem pro excitaci. Nejprve je získán kompletní obraz emitovaný jedním fluorochromem, potom dalšími. Preparát pochopitelně zůstává na stejném místě. Následně lze pomocí softwaru složit získané obrazy do jednoho. Díky tomuto postupu máme v místech překryvu fluorescenčního signálu lépe čitelný obraz.
Další informace
Jaroslava Vávrová
.