OSN-SAbstraktOSN-E

V tomto SOPT dokumentu  jsou uvedeny základní údaje (popis přístroje, princip měření, příprava vzorků, obsluha a ovládání přístroje, údržba, stručně klinický význam a hodnocení výsledků stanovení) o přístroji AAnalyst 100, což je atomový absorpční spektrofotometr s plamenovou atomizací, vyráběny firmou Perkin-Elmer.Tento přístroj umožňuje stanovení celé řady prvků. V biochemických laboratořích se využívá především při stanovení koncentrace stopových prvků biogenních (hořčík, vápník, zinek, měď, ...) i toxických (olovo, kadmium, ...) v různých biologických materiálech ( krev, sérum, moč, vlasy, tkáně, ...).

 

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

 

OSN-SNázev přístroje a identifikaceOSN-E

Atomový absorpční spektrofotometr s plamenovou atomizací.

Typ: AAnalyst 100

Výrobní číslo: 040S8121105

Rok výroby: 1998

Adresa výrobce: Perkin-Elmer Corporation, 761 Main Avenue, Norwalk, Connecticut 06859, USA.

 

OSN-SPrincipOSN-E

Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) je založená na měření absorpce monochromatického záření volnými atomy stanovovaného prvku. Při absorpci energie se elektrony prvku  excitují ze základního do excitovaného stavu. Každý prvek má specifické uspořádání a počet elektronů a proto je pro excitování každého prvku potřebná specifická energie představovaná zářením určité vlnové délky. Aby prvek absorboval energii záření, musí být atomy v atomizovaném stavu. Atomizace, tj. disociace chemických sloučenin na volné atomy se  u tohoto přístroje realizuje při vysoké teplotě 2000 až 3000 °C v plameni acetylen-vzduch, nebo acetylen-oxid dusný to je tzv. plamenová atomizace (jinými využívanými možností atomizace u přístrojů AAS jsou elektrotermální atomizace v grafitové kyvetě, hydridová technika, tj. vytvoření a poté tepelné rozložení těkavých hydridů a technika “studených“ par využívaná při stanovení Hg). Do plamene se vzorek přisává v podobě aerosolu, který vzniká v rozprašovači při nárazu proudu vzorku na rozprašovací kuličku (Nebulizer). Zdrojem záření  jsou nejčastěji výbojky s dutou katodou zhotovenou ze stanovovaného prvku (HKL=Hollow Cathode Lamp). Pro  náročnější aplikace se používají citlivější bezelektrodové lampy (EDL=Electrodeless Discharge Lamp). Paprsek lampy prochází plamenem, kde volné atomy stanovovaného prvku absorbují záření lampy. Úbytek záření, úměrný koncentraci stanovovaného prvku ve vzorku, se registruje fotonásobičem (PMT=Photomultiplier Detector), citlivým v intervalu vlnových délek 190 až 850 nm. Vymezení vyžadované spektrální čáry (částečně realizované již použitím HKL nebo EDL lampy) se přitom zajišťuje monochromátorem (umístěným  mezi plamen a detektor). Funkčním prvkem monochromátoru je difrakční rovinná mřížka s profilovanými vrypy (Grating), na které se svazek rovnoběžných paprsků s různými vlnovými délkami rozloží na spektrum, z kterého se pomocí úzké štěrbiny vymezí potřebná úzká část registrovaná detektorem. Přístroj je konstruován jako dvoupaprskový. Paprsek lampy je pomocí otáčejícího se segmentového zrcadla (Chopper) rozdělován na vzorkový paprsek, který prochází plamenem a srovnávací paprsek nasměrovaný přímo do detektoru. Přístroj porovnává intenzitu srovnávacího paprsku I₀  a vzorkového paprsku I. Je definována absorbance  A jako  A = log (I₀/I) . Absorbance je podle Lambert-Beerova zákona v určitém rozsahu (lineární oblast) úměrná  koncentraci stanovované látky, proto se tento princip nechá používat pro kvantitativní stanovení. Pro odstranění negativního vlivu možných nespecifických absorpcí se používají různé korekce pozadí (Background Corrector). Používá se  deuteriová lampa, jako zdroj kontinuálního záření (jinou možností je například korekce pozadí využívající Zeemanův jev, tj. štěpení energetických hladin v silném magnetickém poli).

OSN-SDefinice a terminologieOSN-E

Charakteristická koncentrace je množství materiálu v jednotkách mg/l, které absorbuje 1% záření ze spektrální lampy (HKL nebo EDL).Absorbce v hodnotě 1% (transmitance 99%) je ekvivalentní 0,0044 jednotek A vypočtených dle rovnice: A = log 1/T = log 1/0,99 = 0,0044. Používá se při AAS s plamenovou atomizací (při elektrotermální AAS se používá analogický pojem charakteristická hmotnost).

Absorbce (elektromagnetického záření) je snížení energie záření  při průchodu hmotou, které vede ke zvýšení energie absorbujícího systému.

Detekční limit (LOD) je zde definován jako koncentrace prvku, která dá poměr signálu k šumu, který bude roven 3.

Blank obsahuje jedno nebo více činidel použitých pro přípravu vzorku, ale záměrně neobsahuje analyt.

Reslope tj. změna směrnice kalibrační křivky pomocí jediného kalibračního standardu (vhodné pro malé úpravy parametrů kalibrační křivky, ke kterým dochází při malých změnách podmínek v přístroji.

 

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky LF UK a FN Plzeň, Alej svobody 80, 304 60 Plzeň

 

OSN-SBezpečnostní aspekty a podmínky prostředíOSN-E

Při práci s atomovým absorpčním spektrofotometrem pracujícím s plamenovou atomizací  jsou mimo jiné následující bezpečnostní rizika vyžadující zvláštní zřetel a opatrnost ze strany obsluhy:

- nebezpečí popálení nejen přímo od atomizačního plamene, ale i od horké hlavy hořáku po vypnutí přístroje

- riziko výbuchu při práci s acetylenem – zamezit unikání acetylenu do ovzduší laboratoře  například špatným

 těsněním u redukčního ventilu apod.; opatrně manipulovat s tlakovou lahví, která musí  být zajištěna proti

 pádu; protože acetylen může reagovat s mědí za vzniku explozivních sloučenin  nesmí se nikdy použít

 měděné plynové vedení ani těsnění; nikdy se nesmí použít místo tlakového vzduchu  kyslík; acetylen

 v tlakové lahvi  je rozpuštěn v acetonu, při poklesu tlaku acetylenu vzrůstá koncentrace acetonu v plynu a

 může dojít  k poškození součástí kontrolního systému plynového vedení, proto je nutné vyměnit

 acetylenovou tlakovou láhev již  při poklesu  tlaku pod  600 kPa; udržovat a kontrolovat funkčnost

 kontrolního a zabezpečovacího systému přístroje (senzory monitorující tlak plynu, přítomnost plamene,

 teplotu vzorkového prostoru) a neporušenost veškerého plynového rozvodu, zvláště po případném vzniku

 zpětného zášlehu plamene do směšovací komory.

- riziko poškození očí ultrafialovým zářením emitovaným plamenem hořáku – během provozu musí být 

 plamen zakrytý ochranným krytem

- riziko toxických zplodin vznikajících při provozu hořáku – musí být zapnuté funkční odsávání

- riziko úrazu elektrickým proudem – při zapojení přístroje se nesmí otevírat žádné kryty a zasahovat uvnitř,

 před každým zásahem je nutné odpojit zařízení od elektrické sítě

- riziko práce s infekčním biologickým materiálem – zachovávat základní hygienická pravidla   

- riziko práce s kyselinami používanými pro před přípravu a ředění vzorků

 

OSN-STeorie, použití, předpoklady provádění postupuOSN-E

Atomový absorpční spektrofotometr je univerzální zařízení umožňující stanovit široké spektrum prvků v ohromné škále materiálů. Touto univerzálností se podstatně liší od jednoúčelových biochemických analyzátorů zkonstruovaných pro jedno nebo jen několik konkrétních stanovení. Plyne z toho ovšem to, že jednotlivá stanovení nejsou předem naprogramována a připravena výrobcem přístroje, ale že je musí připravit, vyladit a validovat (ověřit) obsluha zařízení. K tomu musí znát teorii dějů probíhajících při stanovení na principu AAS. Atomová absorpční spektrofotometrie se vyznačuje poměrně vysokou selektivitou, která do určité míry snižuje nutnost předběžného složitého upravování vzorků (separace, extrakce apod.). Selektivita AAS ale bohužel není úplná a vždy je zapotřebí  prověřit a eventuelně odstranit vliv možných interferencí. Každý používaný princip atomizace má specifické spektrum možných interferencí vyplývajících z fyzikální podstaty dějů probíhajících při atomizaci. Zde jen interference plamenové atomizace, která vzhledem k poměrně nižší teplotě a především ke zřeďování vzorku v plameni hořáku limituje citlivost stanovení (elektrotermální AAS dosahuje řádově až 100 násobně nižší meze stanovitelnosti  AAnalyst 600 PERKIN ELMER, (AAS-ETA) ). K vysvětlení možných typů interferencí jsou v Tabulce 1 uvedeny principy dějů ke kterým dochází v plameni.

Interference se rozdělují na dvě základní kategorie: I. nespektrální (to jsou ty, které ovlivňují formování a počet volných atomů stanovovaného prvku)  a  II. spektrální (tj. ovlivnění absorpce záření lampy jinými látkami než volnými atomy stanovovaného prvku).

 

 

 

 

I. Mezi nespektrální interference se počítají:

 

Interference matrice (Matrix Interference). Příkladem je ovlivnění prvního kroku, tj. nebulizace vzorku rozdílnou viskozitou vzorku. Při vyšší viskozitě vzorku (ve srovnání s viskozitou kalibrátorů) se nasaje menší množství vzorku, tím vznikne menší množství volných atomů a nalezne se menší odezva, tj. nižší koncentrace stanovovaného prvku ve vzorku než odpovídá skutečnosti. Vliv interference matrice lze omezit například větším zředěním vzorku ( to je ovšem z hlediska citlivosti plamenové AAS možné jen do určité míry) nebo použitím metody standardních přídavků.

 

Chemická interference (Chemical Interference). Jedná se především o ovlivnění pátého kroku, tj. tvorby volných atomů při atomizaci. Stanovovaný prvek může být chemicky vázán tak pevně, že energie dodaná plamenem nestačí k disociaci chemické vazby a vytvoření volných atomů. Příkladem je ovlivnění stanovení vápníku přítomností fosfátů ve vzorku. Vzniklý Ca-fosfát není v plameni acetylen-vzduch možné zcela disociovat, takže je-li ve vzorku více fosfátů nalezneme nižší koncentraci vápníku. Vliv  takovéto chemické interference je možné omezit buď použitím teplejšího plamene (acetylen-oxid dusný), nebo  aplikací modifikátoru matrice. V uvedeném příkladu přídavkem lanthanu. Vznikne  La-fosfát a uvolní se Ca, který je potom při atomizaci kompletně převeden na volné atomy absorbující záření lampy.

 

Ionizační interference (Ionization Interference). Disociační proces nekončí vznikem volných atomů, ale přebytek dodané energie může způsobit rozštěpení atomů (sedmý krok v tabulce 1). Tím se sníží počet volných atomů schopných absorbovat  záření lampy a při stanovení se nalezne nižší koncentrace  stanovovaného prvku, než odpovídá skutečnosti. Vliv ionizačních interferencí je možné potlačit buď použitím méně teplého plamene, nebo přídavkem přebytku snadno ionizovatelných prvků (obvykle se používají soli draslíku, rubidia nebo cesia), ze kterých v plameni vznikne velké množství volných elektronů a potlačí se tak ionizace stanovovaného prvku.

 

II. Spektrální interference způsobují, že paprsek lampy není absorbován jen volnými atomy stanovovaného prvku. Nejběžnějším typem spektrální interference je :

 

Absorpce pozadí ( Background Absorption). Je způsobována buď tím, že v důsledku nedostatečně  úzkého vymezení spektra absorbují záření lampy i atomy jiného prvku s blízkou absorpční čarou, nebo tím, že záření lampy absorbují i nedostatečně disociované molekuly případně pevné částice přítomné v plameni. Vznik těchto nespecifických absorpcí je v prvním případě omezován použitím kvalitního monochromátoru a úzké štěrbiny vymezující vstup záření do fotonásobiče, v druhém případě použitím zdroje kontinuálního záření (většinou deuteriové lampy pro kratší vlnové délky a halogenové lampy pro oblast delších vlnových délek). Přístroj je konstruován tak, že střídavě odečítá záření  kontinuálního zdroje a katodové lampy. Jako specifickou absorpci (odpovídající  koncentraci stanovovaného prvku) vyhodnotí přístroj  jen pokles záření katodové lampy nedoprovázený poklesem záření kontinuálního zdroje. Nespecifická absorpce totiž způsobí   úbytek záření obou zdrojů současně.

Korekce pozadí použitím kontinuálního zdroje záření má sice svá omezení, ale pro aplikace plamenové AAS většinou postačuje. Pro náročnější aplikace  elektrotermální AAS se ale více používají jiné principy, jako například korekce pozadí využívající Zeemanův jev, tj. štěpení energetických hladin v  magnetickém poli.

 

V některých zvlášť náročných aplikacích se pro odstranění či omezení interferencí musí přistoupit k předběžným úpravám vzorku, jako je mineralizace (na mokré nebo suché cestě, v otevřeném či tlakovém systému případně s využitím mikrovlnného záření  ETHOS- mikrovlnný tlakový mineralizátor ), extrakce do organických rozpouštědel  apod. Každý takový krok nejen prodlužuje čas potřebný ke získání výsledku a zvyšuje cenu stanovení, ale i zvětšuje riziko případné kontaminace vzorků (např. obsahem stanovovaného prvku v činidlech použitých při mineralizaci), nebo naopak ztráty analytu (například vytěkáním při otevřeném  způsobu mineralizace). Proto je snaha použití těchto před úprav co nejvíce eliminovat. Daří se to i díky stále  dokonalejší konstrukci přístrojů, softwarového vybavení a komerční dostupnosti referenčních materiálů s garantovaným obsahem stanovovaného prvku a ekvivalentní matrici.

 

Nezbytným předpokladem provádění analýz principem AAS je i dokonale zabezpečená preanalytická oblast. Vzhledem k nízkým  stanovovaným koncentracím mohou mít nezanedbatelný vliv  například nečistoty v používaných odběrových nádobkách, kontaminace vzorků z prostředí, ztráty analytu např. absorpcí na stěny nádobky při delším skladování vzorků apod. Toto představuje samostatnou rozsáhlou problematiku přesahující rozsah tohoto dokumentu (Literatura 2).

 

 

 

Tabulka 1

Krok	Děj	Princip	Schéma	Forma
1	Nebulizace (Nebulization)	Kapalný vzorek se rozpráší do směsi vzduch + acetylen	M +  +   A -	Aerosol vzorku
2	Odpaření (Desolvation)	Při zahřátí v plameni se odpaří rozpouštědlo	MA	Pevné částice vzorku
3	Zkapalnění (Liquefaction)	Pevné částice vzorku dalším zahříváním zkapalní	MA	Kapalný vzorek
4	Vypaření (Vaporization)	Dalším zahříváním vzniknou páry vzorku	MA	Plyn
5	Atomizace (Atomization)	Disociují chemické vazby a vzniknou volné atomy stanovovaného prvku. Počet v tomto kroku vzniklých volných atomů odpovídá koncentraci stanovovaného prvku ve vzorku.	M 0  +   A 0	Plyn
6	Excitace (Excitation)	Volné atomy absorbují záření  lampy a přechází do excitovaného stavu	M *	Plyn
7	Ionizace (Ionizaction)	Případný přebytek dodané energie může rozštěpit atomy stanovovaného prvku.	M +  +   e -	Plyn

 

 

OSN-SSpecifikace přístrojeOSN-E

Popis přístroje:

AAnalyst 100 je konstruován ve tvaru kompaktního kvádru. Samostatně je dislokován ovládající PC a tiskárna. V levé části přední stěny je dopředu  otevřený prostor (Sample Area), ve kterém je umístěn nastavitelný hořák (Burner System), nasávací zařízení s nebulizátorem (Nebulizator)a vývod do odpadní nádoby (Drain Vessel). Prostor hořáku se při provozu zakrývá vpravo otvíratelnými dvířky (Burner Door) s krycím UV filtrem, který zabraňuje poškození zraku obsluhy. V pravé části přední stěny je pod vzhůru odklápěným krytem  nastavitelný držák  OSN-Espektrální HKL lampy (Lamp Compartment). Mezi prostorem pro hořák a HKL lampou je na přední stěně lokální ovládací klávesnice, která se ovšem použitím PC vyřazena. Hlavní vypínač přístroje je vpředu dole na pravé stěně přístroje. Připojovací porty a přívody plynů jsou kompletně umístěny na zadní stěně přístroje.

Technické údaje:

Hmotnost přístroje:  68 kilogramů

Rozměry přístroje: délka 97 cm, šířka 87 cm, výška 51 cm

Napětí: 220 V

Kmitočet: 50 Hz

Síťová pojistka: 3,15 A

Ovládání: lokální klávesnicí nebo PC vybaveným programem AAWinlab

Doporučené umístění:

Teplota laboratoře 10-35 °C

Vlhkost vzduchu mezi 20 až 80 %

Čisté prostředí bez kouře, vibrací a korosivních par. Vyloučit přímý sluneční svit na přístroj a umístit přístroj v dostatečné vzdálenosti od topení a alespoň 50 cm od stěny kvůli přístupu k prvkům umístěným na zadní stěně přístroje.

Provozní údaje:

Optický systém: dvoupaprskový

Korekce pozadí: deuteriová výbojka

Monochromátor: Littrow, rozsah vlnových délek 185-860 nm, difrakční mřížka 1800 vrypů/mm, plocha mřížky

                           64x72 mm, šířka štěrbiny 0.2, 0.7 a  2.0 nm

Detektor: fotonásobič citlivý v rozsahu 190-860 nm

Zdroje záření: HKL lampy (Hollow cathode lamps)  a EDL lampy (Electrodeless discharge lamps)

Hořáky: titanové , šířka 10 cm pro provoz acetylen-vzduch  a  5 cm pro provoz acetylen-oxid dusný

 

OSN-SPřídavná zařízeníOSN-E

-         odsávací ventilační zařízení (doporučený výkon 5400-8400 litrů/minutu) umístěné cca 70 cm nad stolem (nad hořákem). Odsávání nad hořákem je důležité, protože: chrání obsluhu před působením toxických zplodin ; chrání přístroj před vznikajícími korosivními zplodinami ; odvádí teplo vzniklé hořením plamene

-         tlaková láhev s acetylenem (vystačí asi na 30 hodin provozu hořáku). Acetylen je rozpuštěn v acetonu, který preventivně zabraňuje explosivnímu rozkladu acetylenu. Přívodní vedení nesmí být z mědi. Doporučený výstupní tlak 83-96 kPa. Láhev se musí vyměnit již při poklesu tlaku acetylenu pod 600 kPa.

-         zdroj tlakového vzduchu (tlaková láhev-vystačí na 5 hodin provozu nebo kompresor) s doporučeným výkonem minimálně 30 litrů/min a  doporučeným výstupním tlakem 350-450 kPa. Kompresor musí být bezolejový a musí být zařazen sušící  filtr odstraňující vzduchu vodu, olej, vodní aerosol a případné pevné částečky. Nikdy se nesmí zaměnit vzduch za čistý kyslík !

-         nádoba pro odpadní systém hořáku ve které se shromaždují nespálené a zkondenzované zbytky aerosolu vytvořeného ze vzorku a vzduchu v nebulizátoru. Odpadní systém (Burner Drain System) má i bezpečnostní funkci, protože svým sifonovým uspořádáním odděluje prostor směšovací komory a hořáku od vnější atmosféry laboratoře.

-         počítač pro řízení přístroje s doporučenou konfigurací: mikroprocesor Pentium alespoň 75 Hz, 16 nebo více MB RAM  paměti, 800 MB hard disk, Windows 95

-         tiskárna pro tisk dat, nejlepší je z hlediska rychlosti tisku laserová, ale stačí i jehličková například EPSON, LX-300.

 

OSN-SReagující substance, nosná media, pomocná činidlaOSN-E

Acetylen, vzduch

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

HKL lampy a D2 lampa (které mají určitou životnost), papír do tiskárny, barva do tiskárny, nádobky na vzorky, špičky pipet 

 

OSN-SKalibrace a kontrola činnostiOSN-E

Atomová absorpční spektrofotometrie je srovnávací analytickou technikou. Koncentrace vzorku je stanovena na základě srovnání změřeného absorbančního signálu se signálem získaným měřením blanku a jednoho nebo více kalibračních standardů. Naměřený signál blanku a kalibračních standardů se nejdříve použije pro sestrojení kalibrační závislosti mezi absorbancí a koncentrací. Potom se změří absorbanční signál vzorku a koncentrace vzorku se vypočte z dříve ustavené kalibrační křivky.

Rovnice kalibrační křivky může sloužit k výpočtu koncentrací vzorků v širokém rozsahu koncentrací. Udávají  se obecná pravidla pro volbu koncentrací kalibračních standardů.

 

 

1.       Praktická spodní mez pro kalibrační křivku je přibližně 20-50 násobek detekčního limitu (LOD). Je ovšem možné provádět analýzy pod praktickou spodní mez kalibrační křivky, ale potom je obvyklé provádět opakování analýz vzorků a blanku.

2.       Horní mez kalibračního rozsahu je často omezena na šestinásobek lineárního rozsahu, pokud jsou pro kalibraci použity alespoň tři kalibrační standardy. Pokud jsou používány pouze dva kalibrační standardy, nebude rozsah použitelnosti kalibrační křivky větší než trojnásobek lineárního rozsahu.

3.       Při používání tří kalibračních standardů by jejich koncentrace měly být zvoleny tak, že koncentrace prvního je přibližně stejné hodnoty jako horní mez lineárního rozsahu, koncentrace druhého je trojnásobek koncentrace prvního a koncentrace třetího je šestinásobek koncentrace prvního (pravidlo 6:3:1)

4.       Pro většinu stanovení jsou vhodné tři kalibrační standardy, avšak programové vybavení dovoluje použití až 15 kalibračních standardů. Další standardy by měly být vloženy mezi standardy splňující pravidlo 6:3:1 tak, aby všechny koncentrace těchto standardů byly rovnoměrně rozmístěny podél kalibrační křivky.

 

Program AA WinLab umožňuje zvolit při editování metody tři základní typy kalibrační křivky:

-         - lineární kalibrace procházející počátkem  souřadného systému (nulovou absorbancí a koncentrací).Rovnice pro tuto kalibrační metodu je: C = K₁ A   , kde C = koncentrace, A = absorbance  a K₁ = směrnice (slope)

-         lineární kalibrace neprocházející počátkem souřadného systému. Blank je považován za první bod kalibrační křivky. Rovnice pro tuto kalibrační metodu je: C = K₁ A + K₂ , kde K₂ je úsek na ose (intercept)

-         nelineární kalibrace procházející počátkem využívá složitější “racionální” rovnici.Signál blanku je vždy měřen první a potom je automaticky odečítán od všech následujících měření signálů,

 

V AA WinLab je zařazen i program pro změnu směrnice (reslope), kterým lze provádět malé úpravy parametrů kalibrační křivky pomocí jediného kalibračního standardu, čímž se korigují malé změny podmínek v přístroji bez nutnosti proměření všech kalibračních standardů.

Naměřené kalibrace lze částečně editovat, tj. lze například vypustit jeden nevyhovující standard apod., ale nelze zadat pouze “teoretickou” kalibraci. Vždy se musí jednat o naměřené hodnoty. Tím je splněna jedna ze zásad SLP, tj. omezení možných zásahů obsluhy.

 

Programové vybavení  dovoluje používat i metodu standardních přídavků, což je metoda která umožňuje analyzovat vzorky, u kterých má matrice značný vliv na směrnici kalibrační křivky. Při použití této metody je analyzován vzorek samotný a vzorek, ke kterému bylo přidáno známé množství analytu. Nalezené absorbance jsou používány k zjištění směrnice kalibrační křivky pro každý vzorek. Metoda standardních přídavků má ale svá omezení (kalibrace musí být lineární, matrice musí mít stejný vliv na přidávaný analyt, jako má na analyt přítomný ve vzorku ) a měla by být používána až jako metoda poslední volby. Vhodnější je omezit vlivy matrice jinými způsoby (před úprava vzorku, jiné podmínky atomizace apod.).

 

Kontrolu činnosti při měření je vhodné provádět například eliminací malých změn programem reslope, vhodným zařazováním standardních referenčních materiálů (SRM= Standard Reference Material), vytvářením regulačních diagramů atd., viz  řízení jakosti.

 

OSN-SÚdržbaOSN-E

Údržbu přístroje je možné rozdělit na následující oblasti:

·         Udržování exterieru celého přístroje v čistém stavu (dle potřeby otřít vlhkým  hadříkem maximálně s trochou detergentu).

·         Údržba hořáku (Burner Head) (čištění štěrbiny hořáku  při jakékoliv známce znečištění, což se projeví nepravidelnostmi v plameni. Čistí se speciálním přípravkem z umělé hmoty (Head cleaning tool 0303-1573), který je v příslušenství. Použití tvrdých předmětů by vedlo k poškození hořáku.

·         Údržba směšovací komory (Burner Chamber) .Intervaly čištění závisí na povaze vzorků. Důležité je čištění po eventuelním nasávaní roztoků s vysokou koncentrací Cu, Ag nebo Hg (mohou vznikat nestabilní acetylidy.

·         Údržba nebulizátoru (čištění měděným drátkem  dodávaným s přístrojem – obj. č. 0303-0135)

·         Údržba odpadního systému (Drain System)  ( dle potřeby čistit vodou event. kartáčkem na zkumavky 

 

OSN-SPracovní postupOSN-E

Vzhledem k tomu, že atomový absorpční spektrofotometr je univerzální zařízení  umožňující  zavádět široké spektrum různých aplikací, je pracovní postup v detailech velmi variabilní  odpovídající vždy konkrétní metodě zavedené a validované (ověřené) obsluhou. V tomto dokumentu proto nejsou uvedeny všechny možnosti, ale pouze rámcový stručně okomentovaný postup:

Veškerý postup je prováděn a řízen přes PC s programem AA WinLab: Zapne se AAnalyst 100,  zapne se PC a ikonou se spustí program AA Win Lab.

Vlastní analýze musí předcházet vytvoření a úprava metody, protože v AAnalyst 100 nejsou žádné předem definované a připravené metody. Jednou připravená metoda se již příště může vyvolat z paměti a nemusí se opakovaně nastavovat.

 

I. Vytváření metod:

1.       V nabídce “File” se stiskne “New Method”. Objeví se text pro vytvoření nové metody.

2.       V tomto textu se vybere stanovovaný prvek a počáteční hodnoty parametrů.

3.       V ikoně “Method Editor” se vyberou a nastaví konkrétní hodnoty parametrů, které jsou vhodné pro prováděnou analýzu.

4.       Zkontrolují se ještě jednou veškeré parametry a v nabídce “Edit”  se stiskne “Check Method”. Přístroj provede kontrolu, zda jsou všechny parametry odpovídající a slučitelné. V záporném případě se objeví seznam chyb.

5.       Uloží se metoda pod vhodným jménem. V nabídce “File” se stiskne “Save Method As”.

6.       Pomocí ikon se otevřou a po pracovní ploše monitoru vhodně rozmístí potřebná okna (Výsledky (Results), Kalibrace (Calibration), Ovládání (Manual), Plamen (Flame)) a v nabídce “File” se stiskne “Save Workspace”. Uloží se tak pracovní prostředí, které se otevře při příštím použití metody a odstraní se tak nutnost opakovaného nastavování pracovní plochy.

 

II. Vytvoření informací o vzorcích:

Pro úsporu plynů a provozního času HKL lamp, je vhodné, při větším množství analyzovaných vzorků, předem připravit údaje o vzorcích a nadefinovat do kterého souboru se budou výsledky ukládat.

1.       V nabídce “File” se stiskne “New Sample Info File” (nebo se použije přímo ikona “Sample Info”). Objeví

se okno editoru informací o vzorcích.

2.       Vloží se údaje o vzorcích (označení, pořadí analýz, jednotky výsledků, analytik,...)

3.       V nabídce “File” se stiskne “Save As Sample Info File...”. Napíše se jméno souboru a stiskne OK.

 

III. Příprava systému pro měření:

1.       Zapne se odsávací zařízení.

2.       Otevřou se uzávěry tlakových lahví s acetylenem a vzduchem.

3.       Vloží se příslušná HKL lampa.

 

IV. Seřízení lampy:

1.       Stiskne se ikona “Lamp”. Objeví se okno “Align Lamps” .

2.       Nastaví se (pokud není kódovaná lampa, která se nastaví sama) prvek, vlnová délka a žhavící proud.

3.       Zapne se lampa stisknutím tlačítka “Set Up”. Naskočí zelený sloupcový ukazatel energie lampy.

4.       Pomocí dvou nastavovacích šroubů u držáku HKL  lampy  se nastaví maximum energie. Kartičkou z tvrdého papíru opatřeného ryskou se vizuelně zkontroluje průběh paprsků lamp nad štěrbinou hořáku a eventuelně se upraví umístění hořáku.

5.       Používá-li se v metodě korekce pozadí, stiskne se ikonka “Bkgnd.Corr.” Objeví se žlutý sloupcový ukazatel energie lampy pozadí.

6.       Pokud se ukazatelé energií dostanou mimo rozsah, stiskne se ikonka “Set Midscale” a ukazatelé se tak nastaví na střed rozsahu.

7.       Uzavře se okno “Align Lamps”

V. Nastavení výšky hořáku:

1.        V nabídce “Tools” se stiskne “Continuous Graphics”. Objeví se okno s kontinuálním grafickým

      ukazatelem  absorbance.

2.        Pomocí šroubu pro vertikální seřízení se sníží hořák tak, aby hlava hořáku byla pod paprsky lampy.

3.        Stiskne se ikonka “Autozero”. Absorbance se vynuluje.

4.        Zvedá se hořák tak dlouho, dokud se nezobrazí absorbance mezi 0,002 až 0,004.

5.        Snižuje se hořák dokud se absorbance nevrátí zpět na 0,000. Pak se navíc otočí ovládacím šroubem o čtvtrkruh  ve směru snížení. Tím se dosáhne,že paprsky lamp jsou těsně nad hlavou hořáku.

 

VI. Zapálení plamene:

1.        V okně “Flame Control” se stiskne ikonka “Bleed”. Tím se naplní přívodní vedení plynů a na průtokoměrech se zkontroluje nastavení vstupního tlaku (většinou vzduch 4 a acetylen 2)

2.        Stiskne se ikonka “Flame OFF/On”. Zapálí se plamen.

 

VII. Nastavení sání nebulizátoru:

1.        V nabídce “Tools” se stiskne “Continuous Graphics”.

2.        Nasává se blank a pokud je signál stabilní, stiskne se “Autozero”.

3.        Nasává se vhodný referenční roztok (Ag, Cu, Mg, Mn nebo Pb), který  dává absorbanční signál o hodnotě asi 0,2 abs.

4.        Uvolní se pojistka nebulizátoru a pomalu se otáčí nastavovací šroub proti směru pohybu hodinových ručiček, dokud se nezačnou objevovat bubliny na  konci trubice ve standardu.

5.        Pomalu se otáčí nastavovací šroub po směru hodinových ručiček. Hodnota absorbance se zvýší až na maximum a potom začne klesat. Nastaví se na maximum.

6.        Zajistí se pojistka.

 

VIII. Optimalizace systému hořáku:

1.       V nabídce “Tools” se stiskne “Continuous Graphics”.

2.       Nasává se blank a pokud je signál stabilní stiskne se “Autozero”.

3.       Nasává se vhodný referenční roztok (Ag, Cu, Mg, Mn nebo Pb), který  dává absorbanční signál o hodnotě asi 0,2 abs.

4.       Pomocí horizontálních a vertikálních šroubů se pozice hořáku nastaví na maximální absorbanci.

5.       V případě potřeby je možné ještě optimalizovat pozici nárazové kuličky v nebulizátoru a průtoky paliva a oxidantu. Potom se opět optimalizuje vertikální pozice hořáku a zkontroluje se, zda hořák nebrání průchodu paprsků lamp tím, že se nasaje blank a absorbance by měla být blízká nule.

 

IX. Změření (vyvolání) kalibrační křivky:

1.       Nasává se blank a stiskne se ikona “Analyse Blank”  v okně “Manual Analysis Control”.

2.       Nasávají se příslušné kalibrační standardy a stiskává se ikona “Analyse Standard”. V Okně “Calibration” se průběžně objevuje grafický záznam měřené kalibrační křivky. Přístroj sám vyloučí nevhodná měření, například neodpovídající pořadí dle koncentrací apod. Kalibraci lze i ručně upravovat: V nabídce “Analyses” se stiskne “Edit calibration” a může se volit který standard zahrnout a který naopak vyloučit z kalibrační křivky. Nelze ovšem zadávat “teoretické” neměřené hodnoty.

3.       V nabídce “Analyses” lze stisknout “Recall calibration” a tím vyvolat kalibraci naměřenou dříve.

4.       Odpovídající nastavení lze zkontrolovat pomocí standardu editovaného v metodě jako “Reslope”. Tím se mohou eliminovat malé změny v nastavení přístroje bez nutnosti měření celé kalibrační křivky. 

 

X. Měření vzorků:

1.       Podle údajů předefinovaných v “Sample Info” se nasávají vzorky a stiskává se ikona “Analyse Sample”.

2.       Podle zvoleného postupu se mezi vzorky vkládají kontrolní materiály používané pro kontrolu kvality (konstrukci kontrolních regulačních grafů)

3.       Uloží se měření v nabídce “File” se stiskne “Save Method”.

 

 

 

XI. Vypnutí systému:

1.       Po analýze posledního vzorku se ještě několik minut nasává destilovaná voda pro propláchnutí celého

      systému hořáku a odpadu.

2.       Vypne se plamen stisknutím tlačítka “Flame Off/On” v okně “Flame Control”

3.       Vypne se HKL lampa tím, že se zadá nulový žhavící proud v okně “Align Lamps”

4.       Vypne se lampa pozadí stisknutím ikonky “Bkgnd.Corr.” v okně “Align Lamps”.

5.       Ukončí se AA WinLab : V nabídce “File” se stiskne “Exit”.

6.       Vypne se AAnalyst 100  hlavním vypínačem.

7.       Vypne se PC a tiskárna.

8.       Uzavřou se tlakové láhve s acetylenem a vzduchem.

9.       Vypne se odsávání.

 

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Atomový absorpční spektrofotometr AAnalyst 100 Perkin Elmer  je zařízení umožňující (po správném nastavení a nakalibrování metody) přesné a správné měření celého spektra prvků principem AAS. Konečný výsledek měření může být ale významně ovlivněn i faktory nesouvisejícími bezprostředně se správnou funkcí analyzátoru (způsob odběru a skladování vzorků apod.). Nejjednodušší cestou zajištění kontroly i těchto faktorů je vkládání kontrolních referenčních materiálů založených například na matrici séra. Tyto materiály se analyzují současně s každou měřenou sérií vzorků. Výsledky měření kontrolních referenčních materiálů se zaznamenávají do regulačních diagramů a umožňují tak trvale sledovat stabilitu (správnost a přesnost) měření. V případě překročení varovných či regulačních mezí se okamžitě prověří situace a odstraní příčina chybného měření. Data těchto kontrolních měření je možné uchovávat v jakémkoliv laboratorním systému umožňujícím konstrukci regulačních diagramů. Vedle uvedené interní kontroly kvality je laboratoř zařazená do externí kontroly kvality (pravidelné kontrolní cykly firmy SEKK). Jakost stanovení je také zajišťována pravidelnou údržbou, která je zaznamenávána do provozního deníku přístroje.

 

 

OSN-SKlinické údajeOSN-E

Atomová absorpční spektrofotometrie se v biochemických laboratořích používá především pro stanovení stopových prvků v biologických materiálech. Za stopové prvky se v současné době považují prvky, které se v lidském organismu vyskytují v koncentraci menší než 1 g na kg hmotnosti. Stopové prvky lze dělit na  esenciální ( železo, zinek, měď, chrom, selen, jod, kobalt, mangan, molybden, nikl, fluor, cín, křemík, vanad), neesenciální ( rubidium, stroncium, antimon) a toxické ( kadmium, olovo, rtuť, hliník). Pojem esenciální a toxický ale nelze brát staticky. Tyto pojmy jsou relativní a závisí na celé řadě dalších faktorů a údajů ( dávka, časová dimenze, chemická forma, individualita organismu, interakce s jinými látkami v prostředí atd.). Tento relativní pohled má obecnější platnost a je velmi důležitý zvláště z hlediska prevence poškození zdraví způsobeného buď nedostatkem, nebo naopak přebytkem určitého prvku (Literatura 1)

Problematika klinických vlastností jednotlivých stopových prvků je uvedena v příslušné literatuře ( Například Literatura 3) a přesahuje rámce tohoto dokumentu.

U každého prvku je vhodné volit jen určitý druh biologického materiálu, tj. například nepožadovat stanovení olova v séru (Pb je převážně obsaženo v erytrocytech) . Stopové prvky se také liší biologickým poločasem. U prvků s krátkým poločasem  OSN-Ese musí  věnovat zvýšená pozornost správné volbě doby odběru. Například při monitorování expozice rozpustným sloučeninám Ni nemá smysl odebírat vzorek na stanovení Ni v moči ráno  na začátku pracovní směny, kdy je jeho koncentrace daleko nižší než na konci směny, ani týden po expozici, kdy je již prakticky veškerý Ni vyloučen.

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

 

OSN-SJiné související informaceOSN-E

 

 

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

1)      Senft, V., Kohout, J. : Patří chrom mezi esenciální nebo toxické prvky? Čas.Lék.Čes. , 135, 1996, s.150-154.

2)      Senft, V., Racek, J., Kohout,J.: Stopové prvky v biologických materiálech. Preanalytické zabezpečení. Čas.Lék.Čes. , 137, 1998, s. 240-243.

3)      Senft, V., Rusňáková, H., Racek, J.: Význam různých možností monitorování hladiny magnesia v organismu. Klin.Bioch. Metabol. , 5, 1997, s. 92-93.

 

OSN-SAppendixyOSN-E

 

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

Zapne se PC,  AAnalyst 100 a program AA WinLab.

1.       Vytvoří se informační soubor o vzorcích.

2.       Zapne se odsávací zařízení, otevřou se tlakové lahve s acetylenem a vzduchem, vloží se HKL lampa.

3.       Seřídí se HKL lampa.

4.       Nastaví se výška hořáku.

5.       Zapálí se plamen hořáku.

6.       Nastaví se sání vzorku nebulizátorem.

7.       Optimalizuje se systém hořáku.

8.       Změří se nová (nebo vyvolá a eventuelně upraví pomocí “reslope” dříve naměřená ) kalibrační křivka.

9.       Změří se vzorky a kontrolní materiály (regulační grafy).

10.    Uloží se výsledky do paměti PC.

11.    Vypne se plamen, žhavení lamp a program AA WinLab.

12.    Vypne se AAnalyst 100, PC, tiskárna, odsávání

13.    Uzavřou se redukční ventily na tlakových lahvích s acetylenem a vzduchem.

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

 

OSN-SDoporučení, recenze, schváleníOSN-E