OSN-SAbstraktOSN-E

Stanovení etanolu v séru (plazmě, celé krvi, eventuelně v moči) na analyzátorech Hitachi, určené pro akutní klinické případy. Využití této metody není vhodné pro soudně lékařské a forenzní potřeby.

 

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

 

OSN-SKódy, názvy, definice a terminologieOSN-E

CAS (Chemical Abstracts Service) Registr č. 64-17-5

Národní číselník laboratorních položek: Etanol (S; látková konc. [ mmol/l] * ), klíč 01730

STAPRO globální číselník: S_ALKH klíč 1254, U_ALKH klíč 2404, B_ETOH klíč 1794

Seznam zdravotních výkonů MZ ČR (1998): 92129;

 

Výrobce setu: Roche Diagnostics GmbH, D-68298 Mannheim, Germany, dodává set na stanovení etanolu v séru (plazmě, moči nebo celé krvi) ve čtyřech různých provedeních určených pro různé typy analyzátorů řady Hitachi:

 

Kat.č.	Obsah	704	717	736	747	902	904	911	914	917	Modular
1776312	19 ml	x	x			x	x	x	x	x	x
1868152	66 ml									x	x
1776282	52 ml		x					x	x
1776304	177 ml			x	x

 

V každém setu je obsažena jedna lahvička pufru (R1) s bílým uzávěrem a dvě lahvičky NAD/ADH (R2) s černým uzávěrem obsahující reagencie v objemu uvedeném v tabulce.

Metoda je využívána jako statimová, dostupná 24 hodin denně v nepřetržitém provozu, při řešení akutních klinických případů, kdy klinická oddělení potřebují rychle potvrdit nebo vyloučit možnost akutní otravy etanolem. Výsledek potom umožňuje zvolit adekvátní způsob léčby.

Metoda není vhodná pro soudně lékařské a forenzní účely.

 

OSN-SPrincip a metoda postupuOSN-E

Enzymatický test prováděný na automatických analyzátorech založený na práci Buchera a Redetskiho.

Ke vzorku séra se přidá R1 – pufr. Přidáním R2 – NAD/ADH se nastartuje reakce:

Etanol + NAD⁺ « Acetaldehyd + NADH + H⁺ , kde je NAD přeměňován na acetaldehyd a NADH působením enzymu alkoholdehydrogenázy ( EC 1.1.1.1). Množství při reakci vznikajícího NADH je přímo úměrné obsahu alkoholu ve vzorku a nechá se určit měřením rychlosti změny absorbance při 340 nm (700 nm).

 

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky Fakultní nemocnice a Lékařské fakulty UK Plzeň, Alej svobody 80, 304 60 Plzeň.

 

OSN-SBezpečnostní aspekty a podmínky prostředíOSN-E

Při práci je zapotřebí zachovávat zásady práce s potenciálně infekčním materiálem ( sérum ).

Viz: Směrnice o bezpečnosti práce [N]

 

OSN-SFáze před vyšetřením (příprava pacienta)OSN-E

Etanol (C₂H₆O nebo CH₃CH₂OH, molekulová hmotnost 46) je bezbarvá čirá tekutina s bodem varu 78,5 °C a specifickou hmotností 0,789 kg/l při 20 °C. Je obsažen ve velkém množství alkoholických nápojů: rum, whisky, slivovice apod. obsahují 30 – 60 %, vína 6 – 12 % a pivo 2 – 5 % etanolu.

V klinické praxi se vyskytují jednak projevy chronického zneužívání (alkoholické léčebny, psychiatrie), jednak akutní otravy způsobené záměrným nebo i náhodným požitím velkého množství etanolu, často ještě v kombinaci s požitím různých léků a drog. Klinická oddělení při těchto případech potřebují rychle potvrdit či vyloučit otravu alkoholem, aby bylo možné zvolit odpovídající terapii. K tomu slouží toto statimové stanovení dostupné 24 hodin denně. Výsledek je k dispozici do cca 30 minut. Stanovení není určeno pro soudně lékařské a forenzní účely, pro které musí být provedena ještě jiná vhodná stanovení založená na jiném principu, jako je například princip plynové nebo vysokotlaké kapalinové chromatografie.

Po požití se etanol rychle vstřebává již v žaludku a to rychleji na lačno, než při současné konzumaci potravy. Etanol rychle proniká prakticky všemi membránami včetně placenty a poměrně rychle se v organismu metabolizuje:

Nejdříve působením alkohol-dehydrogenázy vznikne acetaldehyd

Etanol + NAD⁺ « Acetaldehyd + NADH + H⁺

Acetaldehyd se působením aldehyd-dehydrogenázy dále mění na acetyl-CoA

Acetaldehyd + NAD⁺ « Acetyl-CoA + NADH + H⁺

Konečným produktem metabolizace etanolu je kyselina octová respektive CO₂ a voda. Rychlost eliminace etanolu z organismu je u konkrétního jedince prakticky konstantní ( u mužů asi 100 mg etanolu na kg tělesné hmotnosti za hodinu, u žen jen asi 85 mg/kg/hod ), takže metabolizace je v závislosti na požitém množství ukončena již během 6 – 8 hodin.

Jen asi 5 % z požitého etanolu se vylučuje z organismu v nezmetabolizované formě močí, potem apod.

Může docházet k interakci etanolu s některými léky, hepatotoxickými látkami, steroidy, vitaminy aj.

Na stanovení nemá významný vliv výskyt ikterického a lipemického séra. U hemolytických sér je zapotřebí provést deproteinaci s kyselinou trichloroctovou (viz manipulace s materiálem).

Při stanovení etanolu v moči vadí obsah cukrů v moči, který může způsobit pozitivní interferenci v důsledku metabolizace cukrů na etanol.

V laboratoři, ve které se provádí stanovení by se neměly vyskytovat ani používat roztoky obsahující etanol.

 

OSN-SOdběr primárního vzorku (druh, nádobka, transport)OSN-E

Odběr vzorků pro stanovení etanolu v séru se provádí do normálních odběrových zkumavek a nevyžaduje žádná zvláštní preanalytická opatření. Pouze je nutné zabránit tomu, aby se při odběru na kůži použily desinfekční prostředky obsahující alkohol. Pro odběr plazmy nebo celé krve jsou jako antikoagulanty vhodné heparin, fluorid sodný/šťavelan draselný nebo EDTA.

 

OSN-SOmezení (interference a zkřížené reakce)OSN-E

 

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Vzorky musí být ihned po odběru dobře uzavřené, aby se zabránilo vytěkání stanovovaného etanolu a pokud by se stanovení neprovádělo bezprostředně uchovávají se vzorky v ledničce při 2 – 8 °C.

Pokud by se stanovení provádělo z celé krve, je zapotřebí provést deproteinaci: K 300 µl krve se přidá 300 µl 10 % roztoku kyseliny trichloroctové. Protřepe se a uzavřené se centrifuguje 5 minut při 5000 otáčkách/min. Supernatant musí být čirý a stanovení je nutné provést do 5 minut po centrifugaci.

 

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Laboratorní odstředivka pro přípravu séra.

Automatický analyzátor Hitachi 717 ( ale lze i jiné typy, viz přílohy)

Pipety

 

OSN-SReagencieOSN-E

V setu jsou dodávány obě reagencie připravené k použití.

R1 pufr (bílý uzávěr lahvičky)

R2 NAD/ADH ( černý uzávěr lahvičky): 3 mmol/l NAD + 37 U/ml ADH ( EC 1.1.1.1 )

Poznámka: R1 a R2 musí být umístěné v chlazeném prostoru. Pokud by došlo k vytemperování na teplotu laboratoře, musí se před použitím opět vychladit .

R1 i R2 jsou po otevření stabilní po dobu 90 dní při 2 – 8 °C.

Navíc je třeba připravit 10 % roztok kyseliny trichloroctové pro deproteinaci vzorků krve a dále fyziologický roztok, tj. 0,9 % NaCl.

 

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Špičky k pipetám

Zkumavky pro odběr vzorků

Vzorkové nádobky do analyzátoru

 

OSN-SPříprava k činnostiOSN-E

 

OSN-SPracovní postupOSN-E

Vzorek séra se odlije do nové vzorkové nádobky Hitachi a vloží do vzorkového kruhu analyzátoru. Vzorek se vkládá v dubletu a současně se analyzuje nízký a vysoký kontrolní materiál.

 

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

Vzorek séra se odlije do nové vzorkové nádobky Hitachi a vloží do vzorkového kruhu analyzátoru. Vzorek se vkládá v dubletu a současně se analyzuje nízký a vysoký kontrolní materiál.

 

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Provádí se pouze u nové šarže, nebo pokud by nastaly opakovaně závažné chyby při analýze kontrolních materiálů. Pro kalibraci lze použít například:

STD.(1) CONC.-POS.  [ 0 ]    Fyziologický roztok

STD.(2) CONC.-POS.  [ 1.10 ] Standardní roztok etanolu LACHEMA Kat.č. 1107000 dodávaný v soupravě

                          obsahující 18 ampulí á 1,1 ml v koncentračním rozsahu 0,8 – 3,0 g/l etanolu

 

 

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Měřící rozsah metody: sérum/plazma 0,1 – 5,0 g/l, moč 0,1 – 5,0 g/l, celá krev 0,1 – 5,0 g/l

Při překročení rozsahu se vzorky ředí fyziologickým roztokem ( 0,9 % NaCl ) a opakovaně změří.

 

Detekční limit metody 0,1 g/l je vypočítán jako trojnásobek směrodatné odchylky slepého vzorku.

 

Přesnost metody byla prověřena analyzováním 21 vzorků sér a kontrolních materiálů (údaje výrobce):

 

Vzorek	Opakovatelnost			Reprodukovatelnost
	Průměr	SD	% CV	Průměr	SD	%CV
	mg/l	mg/l		g/l	g/l
Sérum	105,34	0,52	0,5	98,57	2,25	2,3
Nízká kontrola	29,47	0,34	1,2	29,92	0,41	1,4
Vysoká kontrola	192,01	1,03	0,5	191,41	1,80	0,9

 

Správnost byla zkontrolována porovnáním výsledků stanovení etanolu touto metodou v 48 vzorcích (koncentrační rozsah 0,16 – 2,95 g/l ) s výsledky získanými standardní metodou založenou na technice head space plynové chromatografie. Korelace byla velmi dobrá.

 

Specificita: Metoda je specifická pro etanol i v přítomnosti acetaldehydu, acetonu, butanolu, etylenglykolu, izopropanolu, metanolu a propanolu v koncentracích 20 g/l.

 

Interference: Nebyl nalezen významný vliv bilirubinu do 1000 µmol/l, triglyceridů do 11 mmol/l a hemoglobinu do 2 g/l. Významné interference byly vyloučeny i u glukózy, urey a kreatininu v moči.

 

 

OSN-SDokumentace, výpočty, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Výsledky jsou zaznamenávány do laboratorního informačního systému STAPRO, kde se provádí i automatická nebo lékařská kontrola výsledků porovnáváním s klinickými a jinými dostupnými údaji.

Pomocným kriteriem je srovnání naměřené osmolality séra a vypočtenou osmolalitou (2x Na + glukoza + urea). Osmolární gap 23 mmol/kg odpovídá cca 1 ‰ etanolu.

Normálním nálezem je prakticky negativní výsledek.

 

 

Výsledky vzorků se zaznamenávají do laboratorního informačního systému STAPRO spolu s výsledky současně analyzovaných kontrolních materiálů. Přenos výsledků na oddělení je buď automatický počítačovou sítí, nebo po vytištění v papírové formě s hvězdičkovým vyznačením. Protože se jedná o akutní vyšetření hlásí se výsledek na oddělení rovněž telefonicky.

Výsledky se vydávají na jedno desetinné místo v koncentračních jednotkách g/l, to je vlastně v ‰, což je v literatuře i v praxi nejobvyklejší způsob vyjadřování a hodnocení koncentrace etanolu v krvi.

 

OSN-SReferenční, varovné nebo kritické hodnotyOSN-E

 

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Účinky etanolu při požití jsou všeobecně známy. Rychle se vstřebává v gastrointestinálním traktu a dostává se do krve,kde koncentrace (v literatuře běžně udávaná v ‰, čili g/l ) 0,6-0,8 ‰ značí počínající opilost,

1-2 ‰ opilost a přes 2 ‰ těžkou intoxikaci. Nebezpečnou se stává otrava tehdy, mění-li se původní zarudnutí kůže u opilého v hlubokém bezvědomí v bledost a začínají poruchy dýchání. Smrtelná dávka je

6-8 g/kg tělesné hmotnosti ( tedy u dospělého asi 300-500 g etanolu, u dětí méně). Při chronickém používání vznikají nemoci jaterní, poškození ledvin a nemoci nervové. Etanol zvyšuje citlivost organismu na otravy některými látkami (tetrachlormetan, anilin, olovo, rtuť) a dochází k interakci s řadou léků apod.

 

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Každý vzorek se analyzuje v dubletu a současně se analyzují nízký a vysoký kontrolní materiál. Výsledky kontrolních materiálů se zaznamenávají do regulačních grafů s vyznačenými varovnými a regulačními mezemi. Případné překročení těchto mezí by znamenalo okamžité prověření metody včetně rekalibrace a opakování stanovení po odstranění problému.

 

OSN-SPoznámky, zdroje variabilityOSN-E

 

OSN-SJiné související informaceOSN-E

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

Bucher, T., Redetzki, H.: Klin. Wschr., 29, 1951, s. 615 - 620.

 

OSN-SAppendixyOSN-E

Nastavení analyzátorů pro stanovení etanolu v séru:

 

Hitachi 717

TEST	[ ETH  ]
ASSAY CODE	[ RATE-A  ] : [ 32] - [ 46]
SAMPLE VOLUME	[ 10] [ 5]
R1 VOLUME	[ 125] [ 20]
R2 VOLUME	[ 125] [ 20]
WAVELENGHT	[700] [340]
CALIB. METHOD	[ LINEAR ] [ 0] [ 0]
STD. (1) CONC. – POS.	[ 0.00] – [ 1]
STD. (2) CONC. – POS.	[ 1.10] - [ 2]
STD. (3) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
STD. (4) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
STD. (5) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
STD. (6) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
SD LIMIT	[ 0.1 ]
DUPLICATE LIMIT	[ 50 ]
SENZITIVITY LIMIT	[ 0 ]
ABS. LIMIT ( INC/ DEC )	[ 25000 ] [ INCREASE ]
PROZONE LIMIT	[ 0] [ LOWER ]
EXPECTED VALUE	[ 1.00] – [ 5.00 ]
PANIC VALUE	[ 0 ] – [ 0 ]
INSTRUMENT FACTOR	[ 1.0 ]

 

Hitachi 704

TEST	[ ETH  ]
ASSAY CODE	[ RATE-A  ] : [ 21] - [ 29]
SAMPLE VOLUME	[ 14]
R1 VOLUME	[ 175] [ 20]
R2 VOLUME	[ 175] [ 20]
WAVELENGHT	[ 700] [ 340]
CALIB. METHOD	[ LINEAR ] [ 0] [ 0]
STD. (1) CONC. – POS.	[ 0.00] – [ 1]
STD. (2) CONC. – POS.	[ 1.10] - [ 2]
STD. (3) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
STD. (4) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
STD. (5) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
STD. (6) CONC. – POS.	[ 0   ] - [ 0]
SD LIMIT	[ 0.1 ]
DUPLICATE LIMIT	[ 30 ]
SENZITIVITY LIMIT	[ 0 ]
ABS. LIMIT ( INC/ DEC )	[ 25000 ] [ INCREASE ]
PROZONE LIMIT	[ 0] - [ LOWER ]
EXPECTED VALUE	[ 1.00] – [ 5.00 ]
PANIC VALUE	[ 0 ] – [ 0 ]
INSTRUMENT FACTOR	[ 1.0 ]

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Metoda je jednoduchá, rychlá a spolehlivá.

 

OSN-SRecenze, schváleníOSN-E

Autor a spoluautoři: ing. Václav Senft

Recenze:

Vyjádření:

Revize: