Barvicí metodiky likvorové cytologie jsou uvedeny z praktického hlediska a
z hlediska diagnostického významu v
cytologii likvoru. Na metodiky zásadního významu bude v textu upozorněno.
Počítání likvorových elementů barvených kyselým fuchsinem se provádí v
komůrce podle Fuchs-Rosenthala.
Slouží ke stanovení počtu elementů v likvoru, což trvalý
cytologický preparát nikdy neumožňuje. Spočítání elementů v likvoru je nutné
provést zásadně vždy.
Postup:
1)
Ve
zkumavce smícháme 100 l likvoru a
10 l barvicího roztoku, opatrně protřepeme.
2)
Pipetou
směs opatrně naneseme do komůrky pod umístěné krycí sklíčko. Vhodná doba k počítání
je asi 5 až 10 minut po opatrném promíchání.
Příprava barvicího roztoku: Acidi acetici glacialis 90,0 ml Acidi carbolici 6,0 ml Solutionis fuchsini saturatae
6,0 ml
Základní barvení
Na většině evropských pracovišť je jako základního
barvení cytologických preparátů z mozkomíšního moku používáno barvení dle Pappenheima. Jedná se o rutinní
hematologickou metodiku, používanou k barvení nátěrů periferní krve a punktátů
kostní dřeně. Využívá se i v jiných oborech klinické cytologie. Pro cytologii likvorovou se jedná o
nezastupitelnou metodiku.
Postup:
1)
Čerstvě
připravený oschlý preparát se přelije na dobu 4 minut May-Grünwaldovým barvivem.
Jedná se o metanolový roztok eosinu a metylénové modři. Obsaženým metanolem je preparát
zároveň fixován.
2)
Preparát
se převrství krátce destilovanou vodou, pokud možno tak, aby roztok z podložního sklíčka
nepřetekl.
3)
Roztok
slijeme a preparát převrstvíme roztokem podle Giemsy-Romanowského (smícháme 1 ml zásobního
roztoku s 9 ml destilované vody). Barvivy přítomnými v roztoku jsou Azur II-eosin a Azur II.
4)
Preparát
opláchneme destilovanou vodou a necháme důkladně oschnout.
5)
Řádně
suchý preparát montujeme do bezvodého montovacího media, např. do Entellanu (Merck), DePexu, DPX.
Není vhodné montování do jinak běžně používaného kanadského balzámu - u tohoto barvení dochází
postupně k pomalé dekoloraci.
Průkaz přítomnosti železa
Reakce je též nazývána reakcí na berlínskou modř podle
vzniku výsledné komplexní sloučeniny železa, která je zbarvena intensivně modře. Cytochemicky
se jedná o průkaz přítomnosti železa trojmocného. Umožňuje průkaz přítomnosti hematogenního pigmentu hemnosiderinu v
makrofázích po krvácení do likvorových cest.
Postup:
1)
Oschlý
preparát fixujeme přelitím methanolem na dobu 5 minut.
2)
Preparát
přeneseme do kyvety s barvicím roztokem, ten připravíme rozpuštením 1 g ferrokyanidu draselného
v 50 ml vody, do roztoku přidáme 0,5 ml koncentrované HCl. Inkubujeme po dobu 5 minut.
3)
Opláchneme
vodou a přeneseme do barvicího roztoku Oranže G (firma Merck) na dobu 5 min.
4)
Dobarvíme
jádra 0,5 % roztokem jádrové červeni v 5 % roztoku síranu hlinitého nebo
hlinitoamnonného po dobu 5 min.
5)
Po
oschnutí montujeme do Entellanu či jiného bezvodého media.
Reakce PAS Reakce PAS (Periodic Acid +
Schiff's reagent)
- znázorňuje přítomnost polysacharidů a mukopolysacharidů. V případě likvorových elementů se jedná
prakticky výhradně o glykogen. Positivita se projeví výrazně purpurovým zabarvením. Z likvorových elementů se
PAS-positivitou vyznačují typicky granulocyty, dále makrofágy a aktivované monocytární elementy, dosti často některé elementy
maligní.
Postup:
1)
Fixace
methanolem po dobu 5 minut, poté se preparát opláchne vodou.
2)
Preparát
se převrství čerstvě připraveným 1 % vodným roztokem kyseliny iodisté na dobu 10
minut, poté se důkladně opláchne vodou.
3)
Preparát
se ponoří do Schiffova reagens (lze objednat v lékárně či připravit v laboratoři) na 25 minut.
4)
Opláchneme
preparát důkladně vodou a necháme jej lO minut vymývat tekoucí vodou.
5)
Dobarvíme
jádra Harrisovým hematoxylinem 2 minuty nebo 1 % vodným roztokem toluidinové modři 2 minuty.
6)
Po
oschnutí montujeme do Entellanu.
Toto barvení je v některých zemích používáno i jako
základní barvicí metodika v likvorové cytologii. Jinak je vhodné zvláště k odlišení maligních buněk. Oproti
běžně používanému barvení dle Pappenheima se však jedná o metodiku náročnější.
Postup:
1)
Preparát
fixujeme metanolem 5 minut.
2)
Obarvíme
jádra Harrisovým hematoxylinem 2 minuty a preparát vymýváme v tekoucí vodě 5
minut.
3)
Ponoříme
preparát na 5 minut do roztoku Oranže G (Merck).
4)
Přeneseme
preparát do trichromu dle Papanicolaoua (Merck) na dobu 5 min.
5)
Preparát
velmi krátce opláchneme destilovanou vodou, necháme oschnout a montujeme do
Entellanu.
Barvení na nukleoly
Barvení na nukleoly znázorňuje jadérka buněk na pozadí
jaderného chromatinu. Podle morfologických hledisek lze nukleoly rozdělit na kompaktní, prsténčité,
nukleoly s nukleolonematy a na mikronukeoly. Prsténčitá jadérka se vyskytují u
klidových elementů, mikronukeoly ve zcela zralých buňkách, velké kompaktní nukleoly jsou známkou aktivace
buněk, jadérka s nukleolonematy se vyskytují u vysoce aktivovaných elementů a u buněk
maligních. Z toho vyvodíme, že provedení speciálního barvení na nukleoly lze s výhodou využít zejména
při detekci nádorových elementů. Barvení je velmi citlivé na kvalitu použitých chemikálií a přesných parametrů použitého
pufru.
Postup:
1)
Preparát
nesmí být fixován.
2)
Čerstvě
připravený preparát přelijeme barvicím roztokem, který po 10 minutách slijeme.
3)
Preparát
zásadně neoplachujeme, necháme jej ve svislé poloze důkladně oschnout a zamontujeme
jej do Entellanu.
Zásobní roztok připravíme rozpuštěním 1 g toluidinové modři ve 200 ml 10 % ethanolu.
Barvicí roztok pak připravíme smísením zásobního roztoku s
McIlvainovým pufrem o pH 5,0 až 5,2, přibližně v poměru 1:100, ředění je však nutno
vyzkoušet, např. na čerstvě zhotoveném krevním nátěru. Ředění se může dosti lišit u různých šarží barviva.
Barvicí roztok musí být uchováván v chladu.
Průkaz lipidů sudanovou černí B
Průkaz tukových látek pomocí sudanové černi B je
rozšířenou metodikou v hematologii, kde je používán k rozlišení elementů myeloidní řady. Zde se barví
azurofilní granula buněk myeloidní řady a jejich prekursorů. Výsledek barvení je obdobný u
těchto elementů průkazu aktivity peroxidázy. Poměrně spolehlivě lze v tomto barvení odlišit
neutrofilní a eosinofilní granulocyty, neboť eosinofily mají větší granula a tato se
barví intenzivněji. Dále je tohoto barvení v hematologii používáno k průkazu pseudoperoxidasové reakce
hemoglobinu. Barvivo však jinak znázorňuje látky tukové povahy, tím má velký význam při
průkazu lipofágů v likvoru, které fagocytují nekrotickou mozkovou či míšní tkáň. Průkaz
lipofagocytární aktivity není při použití pouze základního barvení vždy dobře možný, neboť
tukové látky jsou zde extrahovány methanolem přítomným v May-Grünwaldově barvivu. Po vyplavení lipidů
zůstávají pak v lipofázích opticky prázdné vakuoly, které nelze odlišit od vakuol aktivovaných
mono cytárních
elementů bez přítomnosti fagocytosy. Sudanofilie granulocytů je jiného původu a k dekoloraci granul
již nedojde ani po aplikaci organických rozpouštědel.
Postup:
1)
Čerstvě
připravený preparát fixujeme 5 až 10 minut formolovými parami v uzavřené nádobce.
2)
Preparát
přeneseme do zfiltrovaného čerstsvě připraveného barvicího roztoku na 20 minut.
3)
Preparát
krátce opláchneme 60 % alkoholem a poté důkladně vodou.
4)
Dobarvíme
jádra 3 % vodným roztokem methylové zeleni l5 až 20 minut, krátce opláchneme vodou a preparát
necháme důkladně oschnout.
5)
Preparát
opatrně převrstvíme pomocí podložního sklíčka Apáthyho sirupem a necháme jej důkladně oschnout.
Nemusíme jej dále montovat.
Zásobní roztok připravíme rozpuštěním 2 g sudanové černi ve 200 ml 95 % ethanolu. Po 3 dnech
roztok přefiltrujeme.
Barvicí roztok zhotovíme smícháním 3 ml zásobního roztoku a 2 ml vody. Roztok musí být vždy
čerstvě připraven a musí být zfiltrován.
Toto barvení má proti barvení sudanovou černí určité
výhody, proto mu v naší laboratoři dáváme přednost. Lépe znázorní tukové kapénky v lipofázích a po
dobarvení jader hematoxylinem umožňuje po zamontování do vodního montovacího media
dlouhodobé uchování kvalitního cytologického preparátu. Hůře jsou rozlišitelná granula elementů myeloidní
řady, což však v likvorové cytologii není příliš na závadu. Další výhodou je kratší
doba barvení.
Postup:
1)
Preparát
fixujeme formolovými parami 5 až 10 minut.
2)
Preparát
přeneseme do čerstvě připraveného barvicího roztoku na 10 minut.
3)
Krátce
opláchneme preparát 60 % alkoholem a poté vodou.
4)
Dobarvíme
jádra Gillovým hematoxylinem (Merck, možno připravit i v laboratoři či lékárnou) 2 minuty
5)
Preparát
vypíráme 5 minut tekoucí vodou.
6)
Po
oschnutí montujeme do vodního montovacího media, doporučujeme Aquatex (Merck), který neodbarvuje
hematoxyliny a umožňuje dlohodobé uchovávání preparátu.
Zásobní roztok připravíme rozpuštěním 1 g olejové červeně O ve 200 ml 99 % isopropanolu. Po 3 dnech
roztok přefiltrujeme.
Barvicí roztok musí být připraven vždy čerstvý, připravíme jej smísením 3 ml zásobního roztoku
s 2 ml destilované vody. Roztok je nutno přefiltrovat.
Barvení baktérií dle Gramma
Grammovo barvení umožňuje v cytologických preparátech
alepoň základní orientaci určením morfologie původce a odlišením baktérií grampositivních a
gramnegativním. Barvení je velmi rychlé a jeho provedení je dobře možné velmi brzy po
dodání vzorku likvoru do laboratoře.
Postup:
1)
Preparát
fixujeme 5 minut methanolem.
2)
Přelijeme
preparát na 1 minutu karbol-genciánem (tj. Gramm I).
3)
Roztok
slijeme a preparát převrstvíme Lugolovým roztokem (tj. Gramm II).
4)
Slijeme
roztok, opláchneme preparát 96 % alkoholem, převstvíme, necháme působit 1 minutu, znovu
opláchneme alkoholem, znovu sklíčko převrstvíme a znovu necháme působit jednu minutu. Poté opět opláchneme alkoholem
a potom vodou.
5)
Barvíme
1 až 2 minuty v barvivu dle Ziel-Neelsena (tj. Gramm IV), ředěném vodou 1:10.
Opláchneme vodou a necháme preparát oschnout.
6)
Montujeme
do Entellanu.
Průkaz mykobaktérií barvením na acidoresistenci
podle Ziel-Neelsena
Barvení na acidoresistenci umožňuje průkaz mykobakterií v cytologických preparátech.
Nutno zde podotknout, že v současné době je u nás záchyt mykobakterií v likvoru vzácností.
Lze vždy doporučit současné provedení Grammova barvení na paralelně zhotoveném preparátu.
Postup:
1)
Fixujeme
preparát methanolem 5 minut.
2)
Preparát
převrstsvíme barvivem podle Ziel-Neelsena a preparát velmi opatrně zahříváme nad
kahanem, celkem 3 x do výstupu par.
3)
Roztok
slijeme, opláchneme kyselým alkoholem, převrstvíme, necháme působit 3 minuty.
4)
Roztok
slijeme, opláchneme vodou, převrstvíme 2 % vodným roztokem malachitové zeleni na 3 minuty.
5)
Opláchneme
vodou, peparát necháme oschnout, montujeme do Entellanu. Kyselý alkohol připravíme přidáním 1 ml
koncentrované HCl do 100 ml 75 % ethanolu.
Průkaz aktivity myeloperoxidázy
Myeloperoxidáza je enzymem typickým pro buňky myeloidní
řady. Výsledek barvení dává podobný obraz jako při použití sudanových barviv. Barvení tedy dobře
odliší granulocytární elementy a jejich prekursory, případně maligní elementy
pocházející z myeloidní řady. Pseudoperoxidasovou aktivitu lze pozorovat v erythrocytech, je podmíněna
přítomností hemoglobinu.
Postup:
1)
Preparát
fixujeme 1 minutu převrstvením 0,5 % roztokem síranu měďnatého.
2)
Fixační
roztok slijeme, neoplachujeme jej, preparát převrstvíme Satoovým činidlem na dobu 2 minut.
3)
Dobarvíme
jádra 1 % vodným roztokem safraninu T 5 minut nebo jádrovou červení (0,5 % roztok
v 5 % síranu hlinitém - vodný roztok).
4)
Preparát
opláchneme, necháme oschnout. Montujeme do Entellanu, kde ale časem dochází k vyblednutí
barevné reakce, případně pouze důkladně oschlý preparát převrstvíme Apáthyho sirupem a dále jej nemontujeme.
Činidlo dle Satoa připravíme rozetřením 400 mg
benzidinu s několika kapkami vody ve třecí misce, přilije se 200 ml destilované vody a přidají se 3
kapky 3 % roztoku peroxidu vodíku. Činidlo musí být uchováno v chladu.
Průkaz aktivity alkalické fosfatázy
Alkalická fosfatáza je enzymem typickým pro neutrofilní granulocyty. Její pozitivita
bude přítomna v neutrofilních granulocytech a v tyčkách. Princip reakce spočívá v
rozštěpení alfa-naftylfosfátu aktivním enzymem přítomným v segmentech. Odštěpený alfa-naftol pak
vytvoří intracelulární sraženinu s vhodnou diazoniovou solí. Při použití běžného barviva
Fast Blue RR je výsledná sraženina hnědočerné barvy.
Postup:
1)
Preparát
fixujeme 30 vteřin formol methanolem (poměr 1:9) uchovávaným v lednici. Poté opláchneme vodou.
2)
Připravíme
zvlášť roztoky 10 mg alfa-naftylfosfátu a 10 mg Fast Blue RR v 5 ml Michaelisova pufru o pH 9,2 -
9,4. Poté oba roztoky smícháme, vzniklý roztok ihned přefiltrujeme a převrstvíme jím preparát.
Necháme působit 45 min.
3)
Preparát
opláchneme destilovanou vodou a dobarvíme jádra methylovou zelení (3 % vodný roztok) 5 až 10
minut.
4)
Oschlý
preparát převestvíme Apáthyho sirupem pomocí krycího sklíčka a necháme důkladně
uschnout. Není potřeba dále montovat.
Průkaz aktivity alfanaftyl-butyrát esterázy
Nespecifická esteráza je enzym, který se z hematogenních elementů vyskytuje v
monocytární řadě. Jeho aktivita je tedy prokazatelná v klidových i v aktivovaných monocytech a v makrofázích. Průkaz
aktivity nespecifické esterázy pomocí alfanaftyl-butyrátu a hexasotovaného
pararosalininu je používán k verifikaci monocytárních leukémií a k průkazu
atypických monocytárních elementů. Aktivita se projeví hnědočerveným zabarvením v cytoplasmě buněk
monocytární řady.
Postup:
1)
Preparát
fixujeme formolovými parami 5 min v uzavřené nádobce.
2)
Smícháme
0,3 ml 4 % vodného roztoku dusitanu sodného (vydrží po přípravě 1 týden) s 0,3 ml
roztoku pararosalininu nebo basického fuchsinu s 8 ml destilované vody a 2 ml
koncentrované HCl. Ten musí být uchováván v lednici.
3)
Po
smíchání obou roztoků přidáme 23,5 ml 0,1 molárního Na2HPO4 a 3 kapky koncentrované
HCl a roztok nastavíme na pH-metru na pH 6,1.
4)
Přidáme
0,9 ml roztoku alfanaftyl-butyrátu (ten připravíme přidáním 1 kapky
alfanaftyl-butyrátu do 10 ml acetonu p.a. (roztok musí být uchováván v lednici, čistý
alfanaftyl-butyrát přímo na mrazáku).
5)
Roztok
přefiltrujeme a ihned aplikujeme na preparát, necháme působit 45 minut, poté opláchneme
vodou a preparát necháme uschnout.
6)
Dobarvíme
jádra 3 % vodným roztokem methylové zeleni 15 minut, opláchne ve vodě a preparát necháme
oschnout. Oschlý preparát montujeme do Entellanu či jej pouze převrstvíme Apáthyho sirupem a necháme důkladně vyschnout.
Imunocytologické vyšetření pomocí monoklonálních
protilátek
V likvoru lze provádět specializovaná imunocytologická
vyšetření k určení specifických tumorových markerů přítomných maligních elementů či k určení CD znaků
lymfocytárních subpopulací. Vyšetření se provádějí pomocí monoklonálních protilátek. U maligních elementů, kde je
jinak přesné specifické určení přítomného nádorového procesu obtížné až nemožné, je pak
možné dosáhnout bližšího určení či přímo stanovení etiologie procesu. U malignit hematologického
původu je pak možné bližší určení stanovením subpopulace, ze které maligní elementy
vycházejí. Vyšetření není vhodné pro stanovení rozložení jednotlivých lymfocytárních populací v
likvoru pro celkově nízký počet zachycených elementů. Zde je možno s výhodou použít
průtokové cytometrie.
Postup:
1)
Preparáty
fixujeme aceton-methanolem (1:1) 5 minut.
2)
Místo
sedimentace elementů na peparátu ohraničíme pomocí štětečku rozehřátou bílou
vaselinou.
3)
Provedeme
blokaci přítomných enzymatických aktivit buněk likvoru azidem sodným (100 mg azidu sodného
rozpustit ve 100 ml destilované vody, přidat 3 ml 30 % H2O2 - roztok musí být vždy čerstvě připraven). Inkubujeme
20 minut při pokojové teplotě.
4)
Preparáty
opláchneme ve vodě, propereme v TBS pufru o pH 7,6 (připraví lékárna) a do
vaselinových rámečků nakapeme roztok monoklonálních protilátek. Ten připravíme smísením
příslušné monoklonální protilátky s bovinním fetálním sérem (BoFeS) 5 % - 150 l BoFeS do 3 ml TBS pufru. Je nutno zachovat ředění, které je u každé monoklonální
protilátky uvedeno výrobcem. Inkubujeme 30 min při teplotě 37°C nebo 45 minut při pokojové
teplotě.
5)
Preparáty
se důkladně opláchnou v TBS a aplikuje se sekundární protilátka značená peroxidázou. Je
možno použít monoklonální protilátky SwaM/Px (prasečí proti myší) nebo SwaR/Px (prasečí proti
králičí), vždy nutno zvolit sekundární protilátku proti příslušné protilátce primární.
Používá se ředění 1:100 v 5 % BoFeSu. Inkubuje se 30 minut.
6)
Preparáty
se opět opláchnou v TBS a do rámečků se aplikuje naředěná terciální protilátka RaSw/Px (králičí
proti prasečí) značená opět peroxidázou. Opět se používá ředění 1:100 v roztoku 5 % BoFeSu v TBS.
7)
Provede
se visulisace navázané monoklonální protilátky pomocí barevné reakce zprostředkované
peroxidasou, kterou je označena sekundární a terciální protilátka. Používá se DAB - diaminobenzidin. Substrát
připravíme rozpuštěním přibližně 28 až 32 mg DAB (tj. 2 x na špičku nože) do 8O ml TRIS
(musí být ohřát na pokojovou teplotu. Roztok se přefiltruje a přidá se 40 ul 30 % H2O2. Preparáty se
inkubují 5 min při 37oC.
8)
Preparáty
se opláchnou v tekoucí vodě a dobarví se jádra buněk 2 minuty v Harrisově hematoxylinu. Poté se
preparáty promývají 5 minut v tekoucí vodě.
Po důkladném
oschnutí se preparáty montují do Entellanu nebo do Aquatexu, kde mají delší životnost.
Pavel
Adam
.