Aquaporin-2 (AQP2, dříve označován WCH-CD nebo AQPCD) je hlavním vodním kanálem
sběrného kanálku ledvin, vyskytuje se rovněž ve varlatech. Je složen z 271 aminokyselin, genový
lokus 12q13. Umožňuje zvýšení prostupnosti
sběrného kanálku pro vodu především pod vlivem ADH, který stimuluje jeho
membránovou lokalizaci v přítomnosti intaktních V2 receptorů pro ADH.
Propustnost sběrného kanálku pro vodu, zprostředkovaná AQP2, je
regulována nejméně dvěma základními mechanismy:
Krátkodobá regulace je zprostředkována translokací AQP2 do apikální
membrány aktivací signální dráhy vazopresinu (ADH). Pokud jsou buňky sběrného
kanálku vystaveny působení ADH, lze prokázat větší hustotu imunoreaktivity AQP2
v apikální membráně a menší hustotu subapikálně. Naopak po ukončení
stimulace vazopresinem se podstatně sníží imunoreaktivita AQP2 v buněčné
membráně a objeví se vyšší denzita imunoreaktivity supranuklárně a subapikálně.
Současně s těmito ději lze prokázat příslušné změny v osmotické
permeabilitě buněk s maximální permeabilitou při stimulaci vazopresinem a
nízkou permeabilitu před stimulací nebo po ukončení stimulace vazopresinem.
Mechanismus označený jako „membrane shuttle hypothesis“, tedy přenos vodního
kanálu z „klidové“ intracelulární lokalizace do buněčné membrány, umožnění
transportu vody a návrat zpět do klidové formy, se předpokládal již před více
než 25 roky. V klidovém stavu je AQP2 lokalizován intracelulárně
v cytoplazmatických váčcích v subapikální oblasti. Celý proces
translokace AQP2 z klidové formy do membrány a zpět je nesmírně
koordinovaný, rychlý, lokalizací specifický a téměř výlučně závislý na ADH.
Jedná se tedy o komplex dějů podmíněný těsnými interakcemi subcelulárních
struktur a všech zúčastněných molekul, včetně buněčného cytoskeletu.
Cyklus AQP2 závislý na
ADH
Spouštěcím mechanismem je vazba ADH na receptor V2, který je lokalizován
na bazolaterální membráně buněk sběrného kanálku. Receptor V2 je spojen
s heterotrimérem Gs proteinu, jeho aktivní forma s GTP (alfa
podjednotka Gs-alfa-GTP) aktivuje adenylcyklázu. Tímto mechanismem vytvořený
cAMP aktivuje protein kinázu A (PKA), která fosforyluje aquaporin-2 (v místě
Ser256 na C-terminální doméně AQP2) a zahájí tak translokaci
cytoplazmatických váčků směrem k apikální membráně. Nezbytně se musí
fosforylovat 3 až 4 monomery AQP2 z celého homotetrameru, aby byla
translokace k membráně úspěšná.
Následně dojde k exocytóze s fúzí váčků s apikální membránou buněk
sběrného kanálku, čímž se zjistí propustnost membrány pro vodu prostřednictvím
aquaporinu-2. Proces fúze membrán cytoplazmatických vesiklů s apikální
membránou neprobíhá náhodně, ale na specificky vybavených místech apikální
membrány. Místa splynutí apikální membrány s membránou vesiklů jsou
vybavena fúzními proteinovými komplexy, u kterých se předpokládá určitá
analogie s komplexy synaptických spojení. V buňkách sběrného kanálku
jsou za fúzi zodpovědné proteiny skupiny tSNARE („target“ SNARE, například
SNAP23 a Syntaxin 4), na vesiklech fúzní proteiny vSNARE („vesicle“ SNARE,
například VAMP-2). Dalšími proteiny fúzního komplexu jsou NSF (NEM-sensitive
factor), SNAP (alpha-soluble NSF-associated protein).
Po dokončení exocytózy je vodní kanál v apikální membráně funkční a
voda vstupuje do buněk sběrného kanálku otevřeným AQP2 podle osmotického
gradientu. Takto reabsorbovaná vody pak buňku opouští bazolaterálně
lokalizovanými aquaporiny-3 a 4. Ukončení stimulace receptoru V2 vrátí
aquaporin-2 zpět do klidového stavu v cytoplazmě, kde je lokalizován ve
vazbě na endosomy. Zpočátku je jako větší váček lokalizován supranukleárně,
zmenšením objemu vazbou na jiné endosomální struktury se posouvá do „ready-to-go“stavu
subapikálně (Takata, 2004).
Fosforylace molekuly AQP2 nemění aktivitu (tj. konduktanci pro vodu)
vodního kanálu jako takovou (nebo jen nepatrně), fosforylace je nezbytná pro
translokaci cytoplazmatických váčků k membráně. Na fosforylaci AQP2 se
mohou podílet kromě PKA i další kinázy, jedná se například o proteinkinázu C
nebo kaseinkinázu II (Golgi Casein Kinase). Naopak léčba antagonisty receptoru
V2 vede ke snížené fosforylaci AQP2. Defosforylaci také může způsobit zvýšená
aktivita fosfatáz.
Translokace cytoplazmatických váčků do membrány je dále ovlivněna
cytoskeletem tubulárních buněk. Mikrotubuly cytoskeletu epitelových buněk mají
svá negativně nabitá ukotvující centra (MTOC, microtubule organizing center)
v blízkosti apikální membrány a kladně nabité konce mikrotubulů vyzařují
směrem k bazolaterální membráně. Možným mechanismem, který ovlivňuje
translokaci vesiklů s AQP2, je působení mikrotubulárních motorických
proteinů (dynein a dynaktin), jednak depolymerizace intracelulárních F-aktinových
filament vázaných na myosin-1 a podobné proteiny. Depolymerizace je
zprostředkována inaktivací Rho opět prostřednictvím PKA (Rho je neaktivní ve
fosforylovaném stavu) a je tedy řízena vazopresinem. Depolymerizovaný F-aktin
nebrání translokaci AQP2 do membrány a dojde tak opět ke zvýšené reabsorpci
vody. Velmi schématicky si lze tento proces představit tak, že aktivní proteiny
dynein a dynactin „přitahují“ cytoplazmatické váčky k apikální membráně a
současně je tato translokace umožněna „rozestoupením“ aktinových mikrofilament.
Dlouhodobá regulace je zajištěna prostřednictvím ADH nebo jinými
mechanismy a je spojena se změnou množství AQP2 v buňkách.
Mechanismus regulace závislý na ADH je iniciován zvýšením cAMP a zahrnuje fosforylaci
(opět aktivací PKA v rámci signální dráhy cAMP) transkripčního faktoru
CREB na Ser133 (cAMP-response element binding protein), který vazbou
na promoter genu pro AQP2 zvyšuje transkripci genu v jádře. Je možné, že
fosforylace CREB proteinu zajišťují i další kinázy, například kalmodulinem
aktivované kinázy II a IV (calmodulin-activated kinase II, calmodulin-activated
kinase IV), které stejně jako PKA fosforylují stejný serinový zbytek (Ser133).
Vzhledem k tomuto faktu je vzestup intracelulární koncentrace kalcia
možným faktorem zvyšujícím expresi AQP2. Další mechanismus ovlivnění
transkripce zajišťuje systém c-Jun/c-Fos. Signální dráha je v uvedených
případech spuštěna vazopresinem a zprostředkována proteinkinázou A. Při
nedostatku vazopresinu se zřejmě uplatňují další ligandy V2 receptoru –
pravděpodobně oxytocin. Efekt fosforylace může být blokován zvýšením aktivity
fosfodiesterázy, kdy je důsledkem přerušení signální dráhy na úrovni cAMP.
Mechanismus regulace nezávislý na ADH je zprostředkován látkami, které zasahují
v signální dráze za V2 receptorem. Modelovým příkladem je aplikace lithia,
které snižuje aktivitu adenylátcyklázy. Dehydratace zvyšuje expresi AQP2
mechanismem nezávislým na cAMP. Hypokalémie a hyperkalcémie snižují expresi
AQP2, ovlivnit expresi může dále ischemie, lokální metabolity, tubulární průtok
při osmotické diuréze (zvýšení exprese), vliv změn efektivní osmolality, duření
buněk při snížení AQP3/4 v bazolaterální membráně (snížení exprese jako
důsledek „naředění“ cAMP nebo mechanické postižení cytoskeletu). Další systém
regulace představují prostaglandiny (prostaglandin PGE2).
Předpokládá se, že PGE2 po vazbě na receptor EP3 jednak
prostřednictví inhibiční dráhy G-proteinu (Gi) blokuje aktivitu
adenylcyklázy, jednak aktivuje Rho. Výsledkem je polymerizace F-aktinu, který
jako bariéra brání translokaci intracelulárních váčků do apikální membrány
tubulárních buněk a dochází tak k polyurii. Existují ale i protichůdné
údaje o vlivu prostaglandinů na expresi AQP2.
Další mechanismy ovlivnění činnosti AQP2 dosud nejsou objasněny. Není
zřejmé, jakou roli hraje aktivace cGMP a PKG (cGMP-dependent protein kinase).
Tímto mechanismem by bylo možné vysvětlit vztah k působení nitroprusidu
sodného, natriuretických peptidů, L-argininu a podobně.
Celý proces signální transdukce, vyúsťující do fúze cytoplazmatických
váčků s apikální membránou tubulárních buněk, je spojen s přestupem 3
– 6 % AQP2 do moče, takže je do určité míry vylučování AQP2 ukazatelem této
regulační dráhy Vylučování AQP2 močí se považuje za marker exprese AQP2 v ledvinách a marker intaktní signální
dráhy regulované vasopresinem (ADH) a tedy schopnosti tubulů reagovat na ADH.
Aplikace ADH (ve formě DDAVP) nebo dehydratace (odnětí tekutin při
koncentračním pokusu) vylučování AQP2 zvyšuje. Zvýšené vylučování AQP2 močí se
dále vyskytuje u infuze hyperosmolálního roztoku NaCl, při SIADH, u srdečního
městnání, u cirhózy, v graviditě, terapii nesteroidními antirevmatiky
(ibuprofen), při ponoření do vody a při léčbě PGI2 (iloprost).
Nálož vodou naopak snižuje vylučování AQP2 močí, podobně je i nízké
vylučování AQP2 moči u centrálního diabetu insipidu z nedostatku ADH, při
léčbě antagonisty V2 receptoru, u kongenitálního nefrogenního diabetu insipidu,
enuresis nocturna a u diabetické nefropatie.
Příčiny a mechanismy snížení AQP2 s hypernatrémií a hyperosmolalitou
(Chen, 2005, Nielsen, 2001)
|
Typ poruchy |
Příklad |
Fyziologický podklad |
|
Snížení AQP2 s hypernatrémií a hyperosmolalitou a polyurií |
geneticky podmíněný nefrogenní diabetes insipidus |
mutace genu AQP2: mutovaný aquaporin-2 není schopen translokace do
apikální membrány |
|
mutace genu AVPR2: mutovaný receptor nerozpozná ADH, důsledkem je
porucha exprese AQP2 a porucha translokace AQP2 |
||
|
defekt tvorby cAMP (v animálním modelu DI +/+ myši) |
||
|
centrální diabetes insipidus |
odpadá vliv ADH na zvýšení exprese AQP2 |
|
|
získaný nefrogenní diabetes insipidus |
lithium: inhibice tvorby cAMP a porucha transdukce signálu |
|
|
hypokalémie: inhibice tvorby cAMP prostřednictvím PGE2 |
||
|
hyperkalcémie: inhibice tvorby cAMP a porucha transdukce signálu |
||
|
postobstruktivní: multifaktoriální – akumulace solutů s následnou
osmotickou diurézou, snížení AQP2, vyskytuje se u bilaterální i unilaterální
obstrukce |
||
|
primární polydipsie |
porucha translokace AQP2 do apikální membrány |
|
|
chronické selhání ledvin, |
multifaktoriální, ischemické nebo cisplatinou indukované akutní selhání
ledvin (polyurická fáze), blokátory kalciových kanálů (nifedipin), věkem
podmíněný nefrogenní diabetes insipidus |
|
|
inhibitory ACE (captopril) |
snížená degradace bradykininu a následující polydipsie z porušené
regulace žízně |
|
|
Snížení AQP2 s hypernatrémií a hyperosmolalitou, porucha
koncentrační schopnosti bez polyurie |
nefrotický syndrom (animální model) |
multifaktoriální, v experimentu vyvolán adriamycinem nebo
puromycin aminonukleosidem |
|
cirhóza (experimentální podvaz společného žlučovodu) |
u kompenzovaných stavů, bez vzestupu AQP2, pravděpodobným mechanismem
„ADH escape“ |
|
|
ischemické akutní selhání ledvin (animální model) |
oligurická fáze, multifaktoriální |
|
|
nízkoproteinová dieta) |
multifaktoriální |
Příčiny a mechanismy zvýšení AQP2 s hyponatrémií a hypoosmolalitou
(Chen, 2005, Nielsen, 2001)
|
Typ poruchy |
Příklad |
Fyziologický podklad
|
|
Zvýšení AQP2 s hyponatrémií a hypoosmolalitou z expanze ECT bez
polyurie |
aplikace DDAVP, SIADH |
zvýšení AQP2 a zvýšený translokace AQP2 do apikální membrány |
|
městnání srdeční |
zvýšení ADH prostřednictvím baroreceptorů s následným zvýšením
syntézy AQP2 a zvýšením translokace do apikální membrány |
|
|
cirhóza (indukovaná CCl4) |
zvýšení ADH přes existující hyponatrémii a hypoosmolalitu, následné
zvýšení AQP2, podílejí se NO a hem-oxygenáza 1 jako mediátory periferní
vazodilatace |
|
|
gravidita |
možný mechanismus „reset osmostat“, alternativně zvýšení ADH
z neosmotických důvodů jako odpověď na arteriální vazodilataci, zvýšená
žízeň |
|
|
hypotyreóza |
multifaktoriální: neosmotické zvýšení ADH s následným zvýšením
AQP2, snížená glomerulární filtrace, porucha reabsorpce iontů, zvýšení AQP3,
AQP4, zvýšení Na+-K+-2Cl- kotransportéru |
|
|
deficit glukokortikoidů |
neosmotické zvýšení ADH z chybějící suprese ADH glukokortikoidy,
zejména po vodní náloži, zvýšení syntézy AQP2 |
|
|
Zvýšení AQP2 s hyponatrémií a hypoosmolalitou s polyurií |
deficit mineralokortikoidů |
neosmotické zvýšení ADH, zvýšení AQP2 a AQP3 |
|
osmotická diuréza |
diabetes mellitus s glukózurií |
Buněčné
a strukturální proteiny
Principy regulace vnitřního
prostředí