Metody stanovení vitamínu K
Extrakce a čištění vzorku
Před zpracováním
biologických materiálů (sérum/plazma) je nezbytná denaturace transportních
proteinů (lipoproteinů). Obvykle se používá srážení etanolem, metanolem nebo
2-propanolem. Vhodné je také použití extrakce na pevné fázi (SPE na bázi
silikagelu).
Chemické metody
·
Fotometrické
a UV-VIS spektrofotometrické metody a rovněž využívání fluorescenčních derivátů je v literatuře
popisováno v souvislosti se stanovením vitamínu K.
·
Titrace
se síranem ceřičitým, polarografie, mikrocoulometrie a fosforimetrie. Tyto
metody jsou v současnosti již nahrazeny převážně separačními technikami.
Chromatografické metody
·
TLC - procedury týkající se dělení vitamínu K lze rozdělit na tři skupiny,
které mohou být vzájemně komplementární
(1) adsorpční chromatografie na normální fázi separující cis-trans izomery,
(2) argentační chromatografie dělí nasycené a nenasycené homology vitamínu K1
(3) chromatografie na reverzní fázi umožňující separaci metylovaných a
demetylovaných K-vitamérů
Navvzdory nástupu HPTLC a rozšiřujících se možnsostí denzitometrického
skenování lze však konstatovat, že současná analýza se přesouvá do oblasti aplikací
v kapalinové chromatografii a význam TLC pro analýzu vitamínu K rapidně klesá
·
GC (plynová chromatografie)
Dlouhé retenční časy a on-column degradace K-vitamérů jsou obvykle odrazujícími
faktory od aplikace plynové chromatografie v analýze vitamínu K. Detekce je
možná plamenově ionizačním detektorem (FID) nebo s využítím detektoru
elektronového záchytu (vyšší senzitivita i selektivita).
·
Kapalinová
chromatografie (LC, HPLC)
Absorpční chromatografie umožňuje separaci cis-
a trans-vitamínů K1. Krom
toho, je to metoda výběru pro čištění extraktů biologických vzorků. Při dobře
definovaných podmínkách je vitamín K separován ze směsí lipidů a postup
zajišťuje podmínky pro použití vnitřního standardu, kterým bývá obvykle homolog
vitamínu K fyiologicky nepřítomný ve sledovaném materiálu. Podobně jako
absorpční chromatografie může být použit systém s normálními fázemi.
Chromatografie na reverzních fázích je rutinně často využívána. Může snadno
separovat vitamín K1 z lipidové směsi s blízkou polaritou a využívá
strukturné blízký analog jako vnitření standard. Podobně jako u ostatních
vitamínů rozpustných v tucích je preferován systém bezvodé reverzní fáze
(zvyšuje solubilitu vitamínu K). Detekce je nejdůležitějším aspektem analýzy
K-vitamérů. Univerzální UV detekce je použitelná pouze pro kvantifikaci
vysokých hodnot vitamínu (např. po podání farmakologické dávky). Vitamín K lze
detekovat elektrochemicky (ECD). Postup s ECD používá vidné mobilní fáze k
zajištění vodivosti elektrolytu. Třetí a většinou preferovaný postup detekce je
fluorimetrická detekce. Příklady aplikací jsou uvedeny v tabulce.
|
Vitamín, analyt |
Metoda, materiál |
Připrava vzorku, kolona, mobilní
fáze |
detekce |
|
vitamín
K K1 |
LC plazma |
denaturace
metanolem, extrakce n-hexanem Ultrasphere
ODS, 5 μm, 25 x acetonitril:dichlormetan
(70:30) |
UV 254 nm |
|
vitamín
K K1 |
LC sérum |
denaturace
etanolem, extrakce n-hexanem Zorbax
ODS, 5 μm 30
mmol/l octan sodný pH 6 v etanol:voda (96,5:3,5) |
FD 340/430 nm |
|
vitamín
K K1 |
LC plazma |
denaturace
etanolem, extrakce n-hexanem RSIL
C18 HL, 5 μm metanol:etyacetát
(96:4) + (CH3)4NB3H8 (2 g/l) |
FD 325/430 nm |
|
vitamín
K K1 |
LC plazma |
denaturace
etanolem, extrakce n-hexanem Hypersil
ODS, 5 μm 2,0
mol/l ZnCl2, 1,0 mol/l octan sodný, 1.0 mol/l kyselina octová v
metanol:dichlormetan (80:20) |
FD 248/418 nm |
·
Imunochemické
techniky
Doposud nejsou známé aplikace stanovení vitamínu K s využitím imunochemických
postupů
Další informace
·
Vitamíny
Literatura
Worsfold P., Townshend A.,
Poole C. Eds.: Encyclopedia of Analytical Science, Second edtion, Academic
press, Elsevier. ISBN 0-12-764100-9. Vol. 9, s. 147-180.
Jaroslava Vávrová