Historicky první metody pro
analýzu vitamínů byly založeny na principu zvířecí bioanalýzy. Později byly vyvinuty
mikrobiologické testy. Chemické postupy stanovení vitamínů
ve vodě rozpustných nastoupily v období před zavedením dalších
specifičtějších a selektivních metod.
Mikrobiologické metody
zahrnuje inkubaci extraktu vzorku s vhodným mikroorganismem, pro jehož růst je
daný vitamín esenciální, nárůst bakterií vzniklých reakcí se monitruje
turbidimetricky, kvantifikace se provádí porovnáním s paralelně inkubovanými
standardními roztoky. Hlavními nevýhodami těchto postupů je dlouhá doba
provedení testu (obvykle 24 h), chemická nespecifičnost výsledku, citlivost k
antibiotikům a dalším inhibujícím látkám.
Chemické metody bez
předchozí separace jsou použitelné omezeně, zejména při analýzách čistých a
koncentrovaných vzorků (potravinářské nebo farmaceutické vzorky). Chemickým
metodám obvykle chybí specifita a senzitivita pro kvantitativní stanovení
vitamínů v biologických vzorcích, nejsou vhodné také ani pro diferenciaci mezi
vitaméry. Biologické vzorky obsahují často řadu neznámých interferentů, které
jsou příčinou nespecifičnosti daného postupu.
V chemických postupech pro
stanovení vitamínů rozpustných ve vodě se odráží chemické a fyzikální
vlastnosti stanovovaných vitamínů (viz též Vitamíny:
stabilita, Vitamíny
rozp. ve vodě).
Příklady:
·
Metoda pro
kvantifikaci vitamínu C je založena na reakci
ketoskupin v dehydroaskorbové kyselině (DHAA) s o-fenylendiaminem, produkt
reakce je fluorescentem. Tento postup zahrnuje oxidaci askorbové kyseliny (AA)
na DHAA. Redukční schopnosti AA mohou být využity při přímém elektrochemickém
(amperometrickém či coulometrickém) měření, úspěšné je měření elektrochemickým
detektorem ve spojení s HPLC separací.
·
Alkalickou
oxidací ferrikyanidem K3[Fe(CN)6] je konvertován vitamín B1- thiamin na inaktivní produkt thiochrom, který
výrazně fluoreskuje v UV světle.
·
Riboflavin vykazuje přirozenou fluorescenci v UV světle. V
alkalickém prostředí může být riboflavin fotochemicky konvertován na
lumiflavin, který lze extrahovat kvantitativně do chloroformu a následně
analyzovat.
·
Přímá fluorimetrie
pyridoxalfosfátu a pyridoxalu (viz Vitamín B6- pyridoxin)
je nespolehlivá pro přítomnost interferujících fluoreskujících látek,
fluorimetrické měření lze provést po předchozím přečištění vzorku.
·
Biotin reaguje s některými činidly. Postupy vedoucí k
diazoderivátům nejsou dostatečně senzitivní. Biotin reaguje s avidinem za
vzniku kompetitivního komplexu, chromofor-fluorescentu.
·
Speccifičtějším
typem chemických reakcí je měření enzymové aktivity koenzymů vitamínů. Tento
způsob je využíván k určení vitamínového deficitu ve tkáních a je příhodný pro
stanovení koenzymové varianty vitamínů. Například k diagnostice deplece thiaminu
může přispět měření enzymové aktivity transketolázy v erytrocytech s a bez
přídavku thiaminpyrofosfátu (TPP).
·
Separační techniky jsou v analýzách vitamínů využívány
často. Tyto metody jsou schopny rozdělit a identifikovat v jedné analýze řadu
vitamínů a vitamerů. Aplikacím pro stanovení vitamínů rozpustných ve vodě
dominuje kapalinová chromatografie, využívá jak univerzální fotometrickou
detekci, tak citlivější fluorescenční, elektrochemické nebo hmotnostní
detektory. Všechny vitamíny rozpustné v tucích a většina vitamínů rozpustných
ve vodě umožňuje univerzální UV detekci. Separace vitamerů a stereoizomerů je
postupem HPLC také možná. Vyšší senzitivity se dosahuje použitím fluorescenční
detekce. Vitamíny buď samy mají fluorescenční vlastnosti (např. retinol, tokoferoly), nebo jsou
kvantifikovány prostřednictvím svých derivátů (např. thiamin). Spojení HPLC s hmotnostní
detekcí přispívá k informacím o struktuře, je to metoda volby pro analýzy
vzorků, které jsou směsí komplexů nebo vzorků s velmi nízkou koncentrací
vitamnu. Příkladem HPLC-MS využití v analýze vitamínů může být stanovení forem vitamínu D.
Plynová a tenkovrstvá
chromatografie jsou v analýzách vitamínů požívány rutinně méně častěji. Hlavní
předností spojení chromatografické techniky s hmotnostní detekcí, specielně
použití izotopové diluce v MS technice, je vysoká senzitivita a přesnost.
Příprava vzorku pro tyto analýzy může být složitější než kupříkladu pro analýzu
kapalinovou chromatografickou metodou.
Trend využívání
nanotechnologií směřuje v poslední době často k aplikacím s využitím
instrumentace kapilární elektroforézy, zejména v oblasti mikroemulzní
elektrochromatografie. Spojení tandemu hmotnostní spektrometrie a kapilární
elektroforézy se jeví jako vhodný postup vysoce citlivého stanovení některých
vitamínů ve složitých biologických matricích.
Enzymové metody jsou využívány
hlavně při stanovení aktuálního stavu saturace organismu vitamíny. Metody
využívají funkce koenzymů. Aktivita vitamin-dependentního enzymu je
interpratována jako stav vitamínu v organismu. Obvykle se stanovuje aktivita
enzymu s a bez aktivace přídavkem koenzymu. Aktivita je sledována měřením změn
koncentrace substrátů nebo produktů reakcí. Řada těchto metod se provádí z plné
krve nebo v erytrocytech, mohou být aplikovány na automatických analyzátorech.
Nevýhodou je komplikovaná standardizace, nestabilita enzymů během skladování a
iterferencí.
Imunochemické metody
zahrnují specifické protein-vázající postupy. Imunochemické testy jsou občas
využívány ke stanovení vitamínů. Jedná se o snadno proveditelné metody
kvantifikace vitamínů v biologických vzorcích. Princip kompetitivní reakce s
použitím radioaktivního nebo fluorescenčního značení je frekventně používán
např. pro stanovení vitamínu B12 nebo folátu.
Další oblastí je jsou
enzymoimunoanalýzy, kdy volný vitamín kompetuje s vitamínem enzymově značeným o
vazbu s protilátkou (příkladem je imunochemické stanovení pyridoxinu).
Problémem používání
imunochemických postupů mohou být zkřížené reakce s ostatními modifikacemi
vitamínu. Výhodou řady imunochemických postupů je krátká doba analýzy a
dostupnost vyšetření na automatických imunoanalyzátorech.
Imunoafinitní chromatgrafie
je využívána k čištění a zakoncentrování vzorků. Vitamín je vpraven na kolonu
obsahující selektivně vázající protein (např. streptavidin). Vitamín je
selektivně zadržen v koloně a po eluci složek nenavázaných na koloně je komplex
vitamín-protein štěpen a nyní již čistý a zakoncentrovaný vitamín je z kolony
uvolněn.
Automatizace v analýzách
vitamínů nabývá v poslední době velkého významu zejména pro rychlou dostupnost
výsledku a možnost zpracování větších sérií vzorků.
Další informace:
·
Vitamíny: příklady
separačních metod
·
Vitamíny: příprava vzorků
k analýze
·
Vitamíny: doporučené denní
dávky
·
Vitamíny
Jaroslava
Vávrová