Toxikologické analýzy

Na přístrojové vybavení je toxikologická problematika velmi náročná a to nejen pro vlastní analýzu, ale již pro preanalytickou přípravu vzorků (viz též bioanalýzy). Vzhledem k rozmanitosti vzorků jsou před vlastní analýzou nutné různé úpravy vzorků:

Pevné vzorky (například vlasy) se musí nejdříve dekontaminovat (mytí střídavě ve vodné a organické fázi a vysušení), zhomogenizovat (promícháváním, mletím, stříháním, vymrazováním), někdy je třeba vysušit do konstantní hmotnosti a vždy je nutné zvážit na analytických vahách množství vzorku braného k analýze. Potom je nutné vzorek převést do roztoku, tj. zmineralizovat (v současné době nejčastěji principem tlakové mikrovlnné mineralizace v uzavřeném systému s přídavkem mineralizačních činidel – např. mikrovlnný tlakový mineralizátor). Někdy je nutná prekoncentrace, aby se dosáhlo měřitelné koncentrace (tj. např. odpaření mineralizačního zbytku téměř do sucha a následné rozpuštění v malém objemu vhodného rozpouštědla).

I kapalné vzorky se před toxikologickým vyšetřením musí často upravovat (např. úprava pH vzorku přidáním vhodného činidla). Některé látky (např. léky aj.) se před analýzou izolují ze složité organické matrice biologického vzorku například vyextrahováním do vhodného organického rozpouštědla nebo se provede chromatografická separace. Omezí se tím počet potenciálně interferujících látek a zjednoduší se identifikace. Extrakce pomocí organických rozpouštědel má obvykle dvě fáze. Nejdříve se získají tzv., bazické výtřepky pomocí pufru o pH 9 a diethyletheru či ethylacetátu. Následně se v pufru o pH 6 pomocí chloroformu či dichlormethanu oddělí tzv. kyselá frakce. V poslední době se stále častěji realizuje extrakce na pevných fázích (silikagel, katexy, anexy).

Plynné a těkavé látky se izolují např. destilací nebo technikou head space, při které se analyzuje rovnovážná plynná fáze nad kapalným vzorkem.

Vlastní analýza vyžaduje přítomnost rozsáhlého spektra analyzátorů a zařízení založených na různých principech.

Příklady:

Spektrální systémy	Spektrofotometrie UV, VIS, IR, plamenová, AAS, ICP MS, aj.
Chromatografické systémy	TLC, GC-MS, LC, HPLC-MS, aj.
Imunochemické systémy	FPIA, MEIA, AMIA, CMIA, EIA, ELISA, aj.
Ostatní	Homogenizace, lyofilizace, izolace, mineralizace, prekoncentrace.

Volba vhodné analytické techniky závisí především na zadání, které je v toxikologii velmi rozmanité a většinou se nejedná o rozsáhlé série stejných vzorků, jaké jsou obvyklé např. v rutinní biochemii, ale o individuální situace.

Pro toxikologický screening intoxikace neznámou látkou se často začíná aplikací jednoduchých imunochemických testovacích kvalitativních systémů, které mohou mít sice do určité míry problematickou specificitu (zkřížené reakce) a jsou k dispozici jen pro určité omezené množství druhů látek (např. 10 základních typů klasických drog), ale jejich použití je velmi jednoduché a rychlé a lze je realizovat v jakoukoliv denní i noční dobu, protože nevyžadují přítomnost erudovaného specialisty. Kvalitativní výsledek, který v prvním období klinikům postačuje, se může v případě potřeby následně kvantifikovat

např. pomocí vhodné chromatografické (viz též bioanalýzy) či spektrofotometrické metody. Chromatografické techniky (GC-MS, HPLC, TLC aj.) se sice vyznačují dobrou specificitou a umožňují stanovit prakticky jakoukoliv organickou látku, ale jsou zdlouhavé, složité a nezbytnou podmínkou je zkušený a erudovaný chromatografista.

Pro screening anorganických látek (např. těžkých kovů) je nejvhodnější technika ICP-MS, ale ta se v klinických laboratořích prakticky nevyskytuje. V indikovaných případech je nutná spolupráce specializovaných laboratoří.

Při monitorování intoxikace známou látkou je situace jednodušší. Znalost látky umožňuje využít rovnou nejvhodnější analytickou techniku. Např. pro monitorování lékové terapie se často používají různé komerčně dostupné kvantitativní imunochemické postupy (FPIA, MEIA, aj.). Pro biologické expoziční testy v průmyslové toxikologii a hygieně (tj. stanovení toxických látek přímo v biologickém materiálu exponovaných osob) se využívají nejrůznější techniky (např. cíleně AAS pro konkrétní těžký kov, aj.).

Kontrola kvality toxikologických analýz

je v některých ohledech specifická. Toxikologická vyšetření totiž většinou nepředstavují velké série víceméně shodných vzorků, obvyklé v rutinní klinické biochemii. Požadavky jsou často unikátní nebo se opakují až v dlouhých a nepravidelných časových intervalech. Někdy je problém získat vhodný referenční materiál se shodnou matricí. Nejsou běžně dostupné systémy mezilaboratorní kontroly.

Nicméně kontrola kvality je důležitá a naprosto nezbytná a je nutná minimálně verifikace parametrů kvality použité metody (přesnost, pravdivost, citlivost, specifičnost, recovery, …). Je zřejmé, jaké negativní důsledky může pro vyšetřovanou osobu mít např. falešně pozitivní (je nevinně zařazený do seznamu osob zneužívajících drogy) nebo naopak falešně negativní nález (neproběhne terapie proti pozdním následkům intoxikace způsobených nerozpoznanou látkou).

Drogy a zneužívané látky

Vedle kvalitativních (semikvantitativních) destičkových či papírkových testů se v klinicko-biochemických laboratořích využívají i různé automatické imunochemické analyzátory umožňující kvantitativní stanovení drog a zneužívaných látek imunochemickým principem.

Využití imunochemických testů

Monitorování drog a zneužívaných látek pomocí kvalitativních (semikvantitativních) imunochemických testů prováděné v klinicko-biochemických laboratořích je většinou určeno pro akutní klinické případy (např. nekomunikující člověk s známkami intoxikace vyžadujícími rychlý terapeutický zásah, nebo kontrola dodržování odvykací terapie, pokud pacient vykazuje známky užití drogy, apod. ). Pro forenzní účely (např. otestování řidiče po havárii jako důkazu pro soudní řízení) se toto monitorování nedá dost dobře použít, třeba i jen z důvodu nedostatečně zajištěného vzorku proti případným náhodným ale i záměrným zásahům (výměna, kontaminace, aj.).

Pro forenzní účely se navíc vesměs vyžaduje výsledek potvrzený minimálně dvěma metodami založenými na rozdílných principech (např. pro etanol GC a Widmarkova zkouška).

Hodnocení výsledků imunochemických testů

Provedení imunochemického monitorování drog a zneužívaných látek je sice velmi jednoduché a rychlé, ale k hodnocení nálezů je nutné přistupovat maximálně opatrně s vědomím omezení těchto průkazů a s nezbytnou dávkou znalostí.

Hlavním problémem a rizikem je možnost falešně pozitivních (nevinný člověk dostane nálepku „feťáka“ s veškerými důsledky pro jeho další pracovní i osobní život) nebo falešně negativních nálezů (možné až fatální následky způsobené nerozpoznáním drogy a tím špatně zvolené či vůbec nerealizované terapie).

Důvod chyb může být ve vlastnostech imunochemických testů.

Např.:

Falešně pozitivní nálezy mohou být způsobené nespecifičností testu, např. různými zkříženými reakcemi strukturně podobných látek (např. metamfetamin – MDMA).

Problém je, že různí výrobci používají různé protilátky a výsledky pak nelze přímo srovnávat.

Př.: U stanovení benzodiazepinů v moči má zcela jiné pořadí citlivosti systém ULTIMED než imunochemický analyzátor Abbott, AxSym. Konkrétní příklad: U benzodiazepinu Midazolamu je pro pozitivní nález na ULTIMEDU nutná koncentrace 12500 µg/l, zatímco u AxSYM jen 200 µg/l. Při testování vzorku moče s koncentrací 1000 µg/l by ULTIMED poskytl negativní nález, zatímco AxSYM pozitivní.

Dalšími důvody chyb může být náhodné, ale i záměrné chování vyšetřované osoby.

Např.:

Falešně negativní nálezy mohou vzniknout nechtěně či náhodně (např. velkým naředěním moče příjmem velkého objemu tekutin před odběrem) ale i záměrně. Testy se totiž často využívají jednak při vyhledávání nových závislých osob, jednak pro kontrolu odvykací terapie známých závislých pacientů.Tyto osoby, protože jsou si plně vědomé negativních následků případného pozitivního nálezu, se snaží nějakým způsobem ovlivnit (zfalšovat) výsledek, tj. pokud možno dosáhnout negativního nálezu. Na základě svých i komunitních zkušeností proto často ředí vzorky močí vodou, ovlivňují pH přidáváním kyselin či zásad, vyvolávají různé oxidační či redukční reakce např. přídavkem dezinfekčních prostředků (SAVO, apod.).

Někteří výrobci imunochemických testů (viz Drogy - rychlý screening v moči) proto nabízí systémy, které současně s průkazem drog provedou i testování na event. naředění moče (hustota, kreatinin), na změnu pH a na event. přítomnost oxidujících či redukujících látek ve vzorku moče.

Jiné chyby mohou vzniknout z důvodu nedostatečné informovanosti kliniků požadujících testování.

Např.:

Často se volí špatná (předčasná nebo naopak příliš pozdní) doba odběru vzorku, kvůli neznalosti biologického poločasu testované látky. Např. odběr vzorku moče 10 dní po předpokládaném zneužití není většinou relevantní, i když např. u chronického užívání THC lze získat pozitivní nález i několik týdnů po poslední aplikaci marihuany.
Požadavek na stanovení benzodiazepinů v moči u léčiva STILNOX není relevantní, protože účinná látka (zolpidem) nepatří mezi benzodiazepiny a imunochemický test zaměřený na strukturu benzodiazepinů ji proto nemůže zachytit. Požadavek vzniká proto, že klinické účinky STILNOXU jsou podobné klasickým benzodiazepinům. Toto je obecný problém u řady psychiatrických přípravků
tzv. 3. generace.
Jiným příkladem (i když mimo rámec imunochemických testů) může být požadavek na stanovení kyseliny hippurové v moči u pacientky opakovaně zneužívající toluen. Požadavek se neustále opakuje z toho důvodu, že výsledek se stále liší od nuly a požadující klinik si neuvědomí, že kyselina hippurová je normální metabolit některých biogenních dusíkatých látek, čili nulový výsledek nelze najít a význam stanovení je jen v nálezu vysokých koncentrací způsobených právě zneužíváním toluenu.

„Nové“ drogy

Obecným, zřejmě nikdy nekončícím, problémem je také to, že uživatelé drog a zneužívaných látek jsou vždy trochu v předstihu před kontrolujícími systémy. Platí to i u kvalitativních destičkových či papírkových imunochemických testů. K dispozici jsou tyto testy pro cca 10 hlavních skupin tzv. „klasických“ drog. V současnosti se ale silně rozšiřuje zneužívání tzv. „nových“ drog, na které imunochemické testy prozatím bohužel nejsou k dispozici.

Příklady „nových“ drog:

„Nová“ droga	Pozn.:
g-hydroxybutyrát (GHB)	„kapalná extáze“, nebezpečný v kombinaci s etanolem
1,4-butandiol	„bouřlivý nektar“, obsažený v některých rozpouštědlech
4-bromo-2,5-dimethoxyfenetylamin	NEXUS
tryptaminy	účinky podobné serotoninu, přírodní na kůži ropuch
ketamin	anestetikum veterinářů, častá příměs extáze
m-chlorfenylpiperazin (mCPP)	inhibitor zpětného vychytávání serotoninu

Další informace

Toxikologie, drogy a zneužívané látky

Václav Senft